本文關(guān)鍵詞：建立從外周血獲得外源基因非整合的誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的方法，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文描述了我們以外周血單核細(xì)胞為誘導(dǎo)的初始材料獲得外源基因非整合的病理特異誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(iPSCs)的過程,并成功獲得5例病人的共64株外源基因非整合的iPSCs細(xì)胞株的成果。我們利用密度梯度離心的方法從外周血中分離得到外周血單核細(xì)胞(PBMNC),經(jīng)過6-7天的富集培養(yǎng)后將攜帶在附加體質(zhì)粒上的外源基因?qū)氲絇BMNC的細(xì)胞內(nèi),經(jīng)過4周左右可誘導(dǎo)得到外源基因非整合的iPSCs。外周血是比較容易獲得人體初始細(xì)胞的來源,而且外周血單核細(xì)胞(PBMNC)群體內(nèi)含有的造血祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞是可以作為很好的誘導(dǎo)iPSCs的初始細(xì)胞,然而在自然狀態(tài)下的這些細(xì)胞的比例很低,經(jīng)過6-7天的富集培養(yǎng)后可以有效地提高它們的比例,并提高iPSCs的誘導(dǎo)效率。本研究采用的血液來自于非梗阻型無精子癥(NOA)患者,NOA是所有的男性不孕不育性疾病中最為嚴(yán)重的一類,環(huán)境因素和遺傳缺陷都可以導(dǎo)致NOA。Y染色體AZF區(qū)缺失與NOA有較高的相關(guān)性,是最常見的一種遺傳缺陷,也是研究得較為清楚的一種。AZF區(qū)缺失導(dǎo)致的NOA在目前仍然沒有行之有效的治療方法,而且由于部分NOA缺失基因在小鼠中不存在,無法建立類似于其它人類疾病的小鼠模型。利用多潛能干細(xì)胞體外分化模擬特定的發(fā)育過程已經(jīng)被證明是一種可行的建立體外模型的方法。我們的鑒定結(jié)果顯示我們獲得的細(xì)胞株在所有已鑒定的特征上均與人胚胎干細(xì)胞類似,具有正常的核型而且沒有載體整合,同時它們還帶有病人原始的基因組缺陷。因而我們獲得的NOA病理特異的外源基因非整合的iPSCs可以被用來建立一個相關(guān)疾病的體外模型,并用其來研究NOA的發(fā)病機(jī)制或者人類精子發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 非整合 外周血
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2;Q813
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章12-24
• 胚胎干細(xì)胞及其應(yīng)用12-13
• iPSCs的出現(xiàn)及其應(yīng)用13-14
• 外源基因非整合的iPSCs14-17
• NOA的概況17
• NOA的發(fā)病原因17-18
• AZF區(qū)缺失引起的NOA18-20
• NOA的治療手段的開發(fā)20-24
• 第二章24-45
• 實驗所用儀器24-25
• 實驗所用材料25
• 實驗所用試劑25-26
• 實驗所用抗體26
• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基26-27
• 培養(yǎng)基添加劑27
• 實驗所用引物27-31
• 實驗所用試劑盒31
• 實驗所用常規(guī)耗材31
• 試劑配置方法31-35
• 實驗方法35-45
• 一. Western blot35-36
• 二. 基因組DNA抽提36-37
• 三. 質(zhì)粒提取37
• 四. 核型分析37-38
• 五. ESC及iPSCs的培養(yǎng),傳代,凍存與復(fù)蘇38-39
• 六. 外源基因非整合iPSCs的誘導(dǎo)39-41
• 七. 免疫熒光41-42
• 八. EB形成與分化42
• 九. 畸胎瘤形成與切片染色42-45
• 第三章45-61
• iPSCs誘導(dǎo)的過程及誘導(dǎo)結(jié)果45-49
• iPSCs的來源鑒定49-50
• 核型鑒定與載體殘余檢測50-52
• iPSCs與ESC細(xì)胞的特征的相似性52-56
• 分化能力檢測56-59
• 遺傳缺陷的鑒定59-61
• 第四章61-66
• 總結(jié)61
• 討論61-66
• 誘導(dǎo)過程及誘導(dǎo)效率61-62
• 較高的建系成功率62-63
• 樣本來源63-64
• 非整合策略的優(yōu)勢64-65
• 材料選擇65-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 致謝72

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