MNNG作為一種單功能烷化劑,被認(rèn)為是環(huán)境中廣泛存在的化學(xué)致癌物。其可以導(dǎo)致DNA斷裂、基因突變甚至腫瘤的發(fā)生。MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)可以激活許多修復(fù)相關(guān)基因。核糖核苷酸還原酶(RNR)催化核糖核苷二磷酸還原為脫氧核糖核苷二磷酸,在DNA合成和修復(fù)過程中起重要作用。人核糖核苷酸還原酶由兩個相同的大亞基(RRM1)和兩個相同的小亞基(RRM2或p53R2)組成兩種RR酶,即RRM1-RRM2和RRM1-p53R2。那么MNNG是否可以影響細(xì)胞中RRM2或p53R2的表達水平,以及通過何種途徑影響至今沒有相關(guān)報道。 本文研究了MNNG誘導(dǎo)RRM2和p53R2轉(zhuǎn)錄上調(diào)的作用和機制。(1)我們發(fā)現(xiàn)MNNG可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑誘導(dǎo)RRM2和p53R2基因表達上調(diào),但不影響RRM1的表達水平。而且,MNNG不僅可以誘導(dǎo)RRM2/p53R2的轉(zhuǎn)錄上調(diào),同時也導(dǎo)致了它們的核轉(zhuǎn)位。(2)通過檢測MNNG處理前后P-H2AX水平,細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡比例,我們發(fā)現(xiàn)RRM2主要參與MNNG誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過程,而p53R2的作用相對較弱。(3)通過DNA pull-down偶聯(lián)LC-MS/MS篩...

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
中文摘要
Abstract
縮略語
目次
1 引言
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 抗體
        2.1.2 胞系
        2.1.3 胞培養(yǎng)及處理用液
        2.1.4 菌株
        2.1.5 細(xì)菌培養(yǎng)基
        2.1.6 質(zhì)粒
        2.1.7 克隆構(gòu)建所需試劑
        2.1.8 siRNA干擾相關(guān)試劑
        2.1.9 轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
        2.1.10 報告基因檢測試劑
        2.1.11 Real-time PCR實驗相關(guān)試劑
        2.1.12 Western blot相關(guān)試劑
        2.1.13 免疫熒光相關(guān)試劑
        2.1.14 DNA pulldown相關(guān)試劑
        2.1.15 銀染
        2.1.16 免疫共沉淀相關(guān)試劑
        2.1.17 染色質(zhì)免疫沉淀相關(guān)試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 胞培養(yǎng)及處理
        2.2.2 基因組DNA的提取
        2.2.3 PCR
        2.2.4 PCR產(chǎn)物的清潔回收
        2.2.5 DNA的凝膠回收
        2.2.6 連接反應(yīng)
        2.2.7 感受態(tài)細(xì)菌的大量制備
        2.2.8 感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化
        2.2.9 細(xì)菌質(zhì)粒DNA的制備
        2.2.10 定點突變
        2.2.11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.2.12 Real-time RT-PCR
        2.2.13 細(xì)胞中全蛋白的提取
        2.2.14 細(xì)胞核蛋白的提取
        2.2.15 Bradford法蛋白定量
        2.2.16 SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫印跡
        2.2.17 報告基因檢測
        2.2.18 免疫熒光
        2.2.19 PI-annexin V染色-流式檢測細(xì)胞凋亡
        2.2.20 DNA pulldown試驗步驟
        2.2.21 免疫共沉淀
        2.2.22 染色質(zhì)免疫沉淀
        2.2.23 統(tǒng)計學(xué)分析
3 結(jié)果
    3.1 MNNG促進RRM2、p53R2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)
        3.1.1 MNNG促進RRM2、p53R2蛋白水平上調(diào)
        3.1.2 MNNG促進RRM2、p53R2 mRNA水平上調(diào)
        3.1.3 MNNG促進RRM2、p53R2啟動子報告基因水平上調(diào)
        3.1.4 翻譯抑制劑CHX可以有效抑制MNNG引起的RRM2、p53R2蛋白水平上調(diào)
        3.1.5 轉(zhuǎn)錄抑制劑ActD可以有效抑制MNNG引起的RRM2、p53R2 mRNA水平上調(diào)
    3.2 MNNG引起RRM2、p53R2核轉(zhuǎn)位,同時入核的RRM2、p53R2參與修復(fù)DNA損傷
        3.2.1 MNNG引起RRM2、p53R2核轉(zhuǎn)位
        3.2.2 上調(diào)的RRM2、p53R2參與MNNG引起的DNA損傷修復(fù)過程
        3.2.3 RRM2表達上調(diào)抑制MNNG引起的細(xì)胞周期阻滯
        3.2.4 RRM2表達上調(diào)抑制MNNG引起的細(xì)胞凋亡
    3.3 RRM2基因的轉(zhuǎn)錄因子篩選
        3.3.1 RRM2基因的轉(zhuǎn)錄因子篩選策略
        3.3.2 RRM2 promoter DNA親和層析-銀染結(jié)果
        3.3.3 RRM2啟動子DNA pull-down蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果及功能分類
        3.3.4 報告基因?qū)嶒灪Y選在MNNG處理后激活RRM2轉(zhuǎn)錄的蛋白因子
        3.3.5 MNNG對E2F3、E2F1及NFY與外源RRM2啟動子DNA結(jié)合的影響
        3.3.6 MNNG對E2F3、E2F1及NFY與內(nèi)源RRM2啟動子DNA結(jié)合的影響
    3.4 MNNG誘導(dǎo)RRM2表達升高依賴于E2F3、NFY的調(diào)控作用
        3.4.1 RRM2啟動子區(qū)包含有多個潛在的E2F、NFY結(jié)合位點,其中RRM2啟動子-227/-110區(qū)段介導(dǎo)了RRM2基因?qū)NNG的應(yīng)答效應(yīng)
        3.4.2 位于RRM2啟動子-227/-110區(qū)段上的E2F、NFY結(jié)合位點對MNNG誘導(dǎo)RRM2啟動子報告基因活性上調(diào)至關(guān)重要
        3.4.3 NFY調(diào)控E2F3、E2F1與外源RRM2啟動子DNA的結(jié)合
        3.4.4 NFY調(diào)控E2F3、E2F1與內(nèi)源RRM2啟動子DNA的結(jié)合
        3.4.5 分別敲低E2F3、E2F1、NFYB對RRM2報告基因活性的影響
        3.4.6 E2F3、E2F1、NFY及p53對RRM2、p53R2基因mRNA水平的影響
        3.4.7 在p53缺失細(xì)胞株H1299中,MNNG對RRM2、p53R2蛋白水平的影響
        3.4.8 E2F1、E2F3、NFY對MNNG引起RRM2蛋白水平上調(diào)的影響
        3.4.9 E2F3調(diào)控RRM2表達上調(diào)在修復(fù)MNNG引起的DNA損傷過程中起重要作用
        3.4.10 E2F3參與修復(fù)MNNG引起的DNA損傷依賴于RRM2
    3.5 E2F3激活RRM2上調(diào)依賴于E2F3與NFY的相互作用
        3.5.1 過表達的E2F3激活RRM2報告基因活性上調(diào),同時此激活作用依賴于NFY
        3.5.2 DP1、NFY及YY1與E2F3具有相互作用
        3.5.3 E2F3與NFY具有相互作用
    3.6 MNNG引起的RRM2表達上調(diào)依賴于ATR-CHK1-E2F3信號通路及NFY的表達上調(diào)
        3.6.1 MNNG誘導(dǎo)E2F3表達上調(diào)不依賴于其mRNA水平
        3.6.2 MNNG處理后E2F3蛋白穩(wěn)定性增強
        3.6.3 MNNG誘導(dǎo)E2F3上調(diào)依賴于上游激酶CHK1
        3.6.4 MNNG激活RRM2表達上調(diào)依賴于ATR-CHK1-E2F3信號通路
        3.6.5 MNNG處理后短時間內(nèi)誘導(dǎo)NFYA、NFYB mRNA水平上調(diào)
4 討論與展望
    4.1 討論
    4.2 展望
5 結(jié)論及創(chuàng)新點
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡歷及在學(xué)期間取得的科研成果



本文編號：3853023