本文關(guān)鍵詞：核因子Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)肺炎支原體LAMPs誘導(dǎo)人THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥物質(zhì)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)是肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)的主要致炎因子。實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)對(duì)Mp LAMPs誘導(dǎo)人單核系THP-1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子、炎癥蛋白及炎癥介質(zhì)的影響,了解Nrf2對(duì)Mp LAMPs所致炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步研究Mp的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。[方法]培養(yǎng)Mp,離心收集菌體沉淀并抽提LAMPs,用BCA法測(cè)定LAMPs濃度。構(gòu)建慢病毒載體p LKO.1-Nrf2 sh RNA,將其與輔助包裝質(zhì)粒(ps PAX2,p MD2G)共同轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞用以包裝慢病毒,將收獲的慢病毒感染體外培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞,嘌呤霉素篩選陽(yáng)性感染細(xì)胞后,western blot和q RT-PCR分別檢測(cè)慢病毒感染后THP-1細(xì)胞Nrf2的蛋白和m RNA水平。用5μg/m L和10μg/m L Mp LAMPs分別刺激Nrf2 sh RNA慢病毒感染的THP-1細(xì)胞和對(duì)照慢病毒感染細(xì)胞,并設(shè)立PBS刺激為陰性對(duì)照組,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用為陽(yáng)性對(duì)照組。ELISA檢測(cè)處理后各組THP-1細(xì)胞白細(xì)胞介素6(interleukine 6,IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukine 8,IL-8)與前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)的表達(dá),Griess法檢測(cè)一氧化氮(nitric oxide,NO)的產(chǎn)生水平,western blot檢測(cè)環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,i NOS)的表達(dá)。7.5μg/m L Mp LAMPs分別刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase,HO-1)特異性激動(dòng)劑鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin,Co PP)或HO-1特異性抑制劑鋅原卟啉(zinc protoporphyrin,Zn PP)預(yù)處理的THP-1細(xì)胞,Nrf2 sh RNA慢病毒感染細(xì)胞,對(duì)照病毒慢感染細(xì)胞及PBS處理的THP-1細(xì)胞,運(yùn)用熒光探針2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2',7'-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)檢測(cè)ROS的產(chǎn)生水平。[結(jié)果](1)測(cè)序結(jié)果顯示所構(gòu)建的p LKO.1-Nrf2 sh RNA慢病毒正確。與對(duì)照慢病毒感染及PBS處理的THP-1細(xì)胞相比,p LKO.1-Nrf2sh RNA慢病毒感染細(xì)胞Nrf2 m RNA表達(dá)水平分別抑制了64.73%與62.98%,而Nrf2的蛋白表達(dá)量分別抑制了44.43%與40.48%;Mp LAMPs處理后p LKO.1-Nrf2 sh RNA慢病毒感染細(xì)胞Nrf2 m RNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)量分別降低了66.12%與52.12%;(2)Mp LAMPs刺激顯著增強(qiáng)了THP-1細(xì)胞中IL-6、IL-8、COX-2、i NOS、PGE2的表達(dá)水平與NO和ROS的產(chǎn)生水平。Mp LAMPs刺激Nrf2 sh RNA慢病毒感染的THP-1細(xì)胞后,IL-6、IL-8與PGE2的表達(dá)水平分別為150.09pg/m L,196.18pg/m L和123.88 pg/m L,較對(duì)照慢病毒感染的THP-1細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8與PGE2(分別為75.03pg/m L,90.09pg/m L與66.42pg/m L)顯著增高(p0.05);Mp LAMPs刺激后,Nrf2基因沉默組THP-1細(xì)胞表達(dá)的COX-2、i NOS蛋白水平較對(duì)照組分別升高了20.37%與26.65%(p0.05),Nrf2基因沉默組THP-1細(xì)胞產(chǎn)生的NO與ROS分別較對(duì)照組增加了73.17%與19.57(p0.05);(3)與無(wú)處理細(xì)胞相比較,ROS清除劑NAC預(yù)處理THP-1細(xì)胞后Mp LAMPs刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平降低了8.28%,而Mp LAMPs誘導(dǎo)細(xì)胞HO-1 m RNA的表達(dá)水平升高了12.76倍;與無(wú)處理細(xì)胞相比較,HO-1特異性激動(dòng)劑Co PP處理組Mp LAMPs刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平降低了7.64%,而HO-1特異性抑制劑Zn PP處理組Mp LAMPs刺激細(xì)胞產(chǎn)生的ROS的水平升高了15.28%。[結(jié)論]Nrf2能夠負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-8、COX-2、i NOS、PGE2與產(chǎn)生NO和ROS。
【關(guān)鍵詞】：肺炎支原體 脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白 核因子E2相關(guān)因子2 炎癥
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R375
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-15
• 第1章 緒論15-19
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料19-23
• 2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器19-20
• 2.2 支原體菌株20
• 2.3 細(xì)胞株20
• 2.4 質(zhì)粒20
• 2.5 實(shí)驗(yàn)主要試劑20-21
• 2.6 主要抗體21
• 2.7 培養(yǎng)基及溶液配制21-22
• 2.8 其他22-23
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法23-41
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存與復(fù)蘇23-24
• 3.2 pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建、包裝與感染24-29
• 3.3 Mp LAMPs的抽提，，內(nèi)毒素及濃度測(cè)定29-32
• 3.4 ELISA檢測(cè)IL-6、IL-8、PGE2的表達(dá)水平32-33
• 3.5 Griess法檢測(cè)NO的產(chǎn)生33-34
• 3.6 Western Blot檢測(cè)Nrf2、iNOS與COX2蛋白的表達(dá)34-36
• 3.7 Nrf2對(duì)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生ROS影響的檢測(cè)36-37
• 3.8 qRT-PCR檢測(cè)Nrf2 mRNA與HO-1 mRNA的表達(dá)水平37-39
• 3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析39-41
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-56
• 4.1 構(gòu)建pLKO.1-Nrf2 shRNA慢病毒載體41
• 4.2 檢測(cè)Nrf2 shRNA慢病毒感染對(duì)THP-1 細(xì)胞Nrf2的干擾效果41-43
• 4.3 Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞表達(dá)IL-6、IL-843-45
• 4.4 Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞表達(dá)COX-245-47
• 4.5 Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞表達(dá)i NOS47-48
• 4.6 Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞表達(dá)PGE248-50
• 4.7 Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生NO50-51
• 4.8 Nrf2負(fù)向調(diào)節(jié)Mp LAMPs刺激THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生ROS51-52
• 4.9 NAC與HO-1 抑制Mp LAMPs刺激THP-1 細(xì)胞產(chǎn)生ROS52-56
• 第5章 討論56-60
• 第6章 結(jié)論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-68
• 綜述68-80
• 參考文獻(xiàn)75-80
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要研究成果80-81
• 資助本論文的科研項(xiàng)目81-82
• 致謝82

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本文編號(hào)：359909