本文關(guān)鍵詞：弗氏志賀菌熱休克蛋白HtrA蛋白酶功能及翻譯后修飾的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：志賀菌(Shigella spp.)是一種具有高度傳染性的革蘭氏陰性腸道病原菌,兒童和農(nóng)民是易感人群。志賀菌的感染劑量極低,且存在著多重耐藥性,致使志賀菌的預(yù)防及治療存在著極大挑戰(zhàn),針對志賀菌疫苗的研制更是重中之重。志賀菌攜帶的Ⅲ型分泌系統(tǒng)是對抗宿主免疫系統(tǒng)的重要武器,而毒力因子Ics A(Vir G)是其在宿主細(xì)胞間有效擴(kuò)散所必需的。有研究表明,Htr A可以促進(jìn)Vir G在細(xì)菌表面的準(zhǔn)確定位,扮演著毒力因子的角色。此外,志賀氏菌的傳播方式為糞口途徑,在抵達(dá)其定植部位大腸之前,首先需要耐受胃酸等極端環(huán)境。目前在多種病原菌中已報道,Htr A對于細(xì)菌在高溫、偏酸或偏堿性等極端環(huán)境下的生長具有重要作用。因此,對于Htr A蛋白酶功能的研究可以幫助我們發(fā)現(xiàn)更多的毒力相關(guān)蛋白,以便更好的了解志賀菌的具體致病機(jī)理,從而為疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。Htr A蛋白在多數(shù)病原菌中序列保守,具有分子伴侶和蛋白酶活性雙重功能,存在于周間質(zhì),是周間質(zhì)內(nèi)蛋白的重要質(zhì)量調(diào)控因子。目前關(guān)于Htr A蛋白的報道,大多是針對它的分子伴侶和蛋白酶活性進(jìn)行研究。然而,在實驗室前期關(guān)于Arg T蛋白的研究中我們發(fā)現(xiàn),Htr A蛋白在雙向電泳膠圖上呈現(xiàn)分子量相同但等電點不同的兩個蛋白點,且兩個蛋白點之間會根據(jù)底物變化出現(xiàn)“此消彼長”的現(xiàn)象。于是我們推測,Htr A可能存在著某種翻譯后修飾。目前,針對Htr A蛋白的研究中尚未有關(guān)于此現(xiàn)象的報道。我們將從蛋白酶活性和翻譯后修飾兩方面對Htr A蛋白進(jìn)行具體研究。擬通過本研究,找出志賀菌中Htr A的潛在底物蛋白,鑒定出更多毒力相關(guān)蛋白,為更好的了解志賀菌的致病機(jī)理提供依據(jù)。此外,通過已經(jīng)解析出的晶體結(jié)構(gòu)結(jié)合實驗分析,在全新領(lǐng)域?qū)tr A蛋白進(jìn)行研究,找出潛在的修飾位點并確定修飾形式。在Htr A蛋白酶活性的研究中,我們首先構(gòu)建htr A的上調(diào)表達(dá)菌株和下調(diào)表達(dá)菌株。然后利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對比不同表達(dá)菌株的蛋白表達(dá)譜,分析潛在的底物蛋白。其中,上調(diào)表達(dá)利用外源導(dǎo)入阿拉伯糖操縱子實現(xiàn)可控誘導(dǎo);下調(diào)表達(dá)則選擇CRISPRi技術(shù)進(jìn)行沉默。由于志賀菌的基因組存在大量可移動元件,特別是毒力核心區(qū)的自發(fā)突變率很高,因此在成功構(gòu)建htr A上調(diào)和下調(diào)表達(dá)菌株后,需要對毒力基因進(jìn)行PCR驗證,以確保毒力核心區(qū)和基因組的完整性,以及后續(xù)研究的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。測序和毒力PCR驗證完全正確的菌株,再使用自制的Htr A蛋白多克隆抗體,通過Western Blot檢測Htr A蛋白表達(dá)的變化,實驗結(jié)果證實上述上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)菌株均構(gòu)建成功。菌株構(gòu)建成功后,我們選擇雙向電泳技術(shù)對蛋白進(jìn)行分離,再通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析可能存在的底物蛋白,并利用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行蛋白點的鑒定。由于Htr A蛋白存在于周間質(zhì),因此要尋找其天然底物蛋白,最直接的方法是提取周間質(zhì)蛋白進(jìn)行分析。另外,Htr A蛋白也參與外膜蛋白的合成,需提取外膜蛋白進(jìn)行輔助驗證。最后再通過全菌蛋白表達(dá)譜的對比,可進(jìn)一步證明實驗結(jié)果。在周間質(zhì)蛋白提取物的表達(dá)譜分析中,我們選擇不同溫度(30℃發(fā)揮分子伴侶活性和37℃發(fā)揮蛋白酶活性)條件下的htr A上調(diào)和下調(diào)表達(dá)菌株周間質(zhì)蛋白進(jìn)行對比研究。最終的質(zhì)譜結(jié)果分析得出:Pho N1、Pho N2和Gln H蛋白為潛在底物蛋白。其中Pho N1和Pho N2擁有50%的序列一致,均為周間質(zhì)中的一種非特異性酸性磷酸酶。兩者在37℃條件下提取的周間質(zhì)蛋白中,htr A上調(diào)表達(dá)時,均出現(xiàn)明顯的表達(dá)量偏低現(xiàn)象。然而在30℃時提取的周間質(zhì)蛋白中,我們發(fā)現(xiàn)不同菌株間Pho N1和Pho N2蛋白表達(dá)量均沒有明顯差異,說明上述兩個蛋白的差異表達(dá)與Htr A的分子伴侶活性無關(guān)。因此,推測Pho N2和Pho N1是Htr A的底物蛋白。此外,我們還發(fā)現(xiàn)在37℃條件下,周間質(zhì)谷氨酰胺結(jié)合蛋白Gln H的變化趨勢與Htr A蛋白的變化趨勢截然相反,而在30℃卻無明顯差異,因此懷疑Gln H蛋白也是Htr A蛋白的底物蛋白。在37℃條件下外膜蛋白提取物的蛋白表達(dá)譜分析中,我們發(fā)現(xiàn)在Htr A蛋白的表達(dá)量降低時,外膜蛋白Omp A的表達(dá)量也隨之降低。這一現(xiàn)象也驗證了Htr A蛋白參與Omp A的合成一說。此外,在37℃條件下全菌蛋白表達(dá)譜的分析中,我們發(fā)現(xiàn)Pho N2的變化趨勢同它在37℃時周間質(zhì)中的變化相似,進(jìn)一步證實了Pho N2是Htr A的底物蛋白。由于Pho N1的等點點為6.9,而全菌蛋白使用的是p H 4-7和p H 6-11的膠條進(jìn)行的雙向電泳,因此在最終的兩個p H梯度膠圖中都不能夠鑒定到Pho N1蛋白。在關(guān)于Htr A的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體研究中,先選擇酶活位點突變株進(jìn)行雙向電泳,得到膠圖上的Htr A仍為兩個蛋白點,因此首先排除了酶活位點存在修飾的可能性。接著,采用高精度液相質(zhì)譜先對雙向膠圖上的兩個蛋白點進(jìn)行分析。經(jīng)Typsin、GLu-C、Chymotrypsin三種酶分別對Htr A的兩個蛋白點進(jìn)行消化后得出:修飾位點可能落在57-63位氨基酸區(qū)間。該區(qū)段位于Htr A晶體結(jié)構(gòu)中的柔性Q-linker區(qū)域內(nèi)部,無明確的三維結(jié)構(gòu)定位,所以我們只能利用丙氨酸掃描逐個分析可能存在修飾的位點。我們通過對57位C、58位Q、59位E、61位S四個氨基酸進(jìn)行定點突變,得到301/C57A、301/Q58A、301/E59A、301/S61A點突變株。雙向電泳結(jié)果顯示,這些突變株的雙向電泳圖譜中,Htr A均為兩個蛋白點。因此,我們可以基本排除C57、Q58、E59和S61位存在修飾的可能性。綜上所述,本研究通過外源阿拉伯糖操縱子構(gòu)建htr A上調(diào)菌株,CRISPRi技術(shù)構(gòu)建下調(diào)表達(dá)菌株。之后,用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析37℃和30℃不同溫度條件下,不同菌株周間質(zhì)蛋白的表達(dá)差異情況,再輔以外膜差異表達(dá)蛋白和全菌差異表達(dá)蛋白進(jìn)行驗證,最終得出可能的底物蛋白為周間質(zhì)蛋白Pho N1、Pho N2和Gln H。同時驗證了Htr A參與Omp A的合成。對于Htr A可能存在的翻譯后修飾,我們通過本研究,基本排除了S210、C57、Q58、E59和S61幾個潛在的修飾位點,目前還不能確定具體的修飾位點及形式。
【關(guān)鍵詞】：弗氏志賀菌 熱休克蛋白HtrA 雙向電泳 CRISPRi 丙氨酸掃描
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 縮略詞一覽表5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-19
• 第一章 志賀菌HTRA上調(diào)及下調(diào)表達(dá)株的構(gòu)建及驗證19-35
• 1. 材料19-22
• 1.1 菌株及載體19-20
• 1.2 主要耗材20-21
• 1.3 實驗試劑配方21-22
• 2 方法22-28
• 2.1 htrA基因上調(diào)、下調(diào)表達(dá)株的構(gòu)建22-25
• 2.2 htrA上調(diào)和下調(diào)表達(dá)株的構(gòu)建25-26
• 2.3 HtrA抗體的制備26-28
• 2.4 Western blot驗證突變株28
• 3 結(jié)果與分析28-33
• 3.1 htrA上調(diào)、下調(diào)表達(dá)菌株構(gòu)建及毒力基因的PCR驗證28-30
• 3.2 HtrASA-GST多克隆抗體的制備30-32
• 3.3 Western Blot檢測上調(diào)及下調(diào)表達(dá)效果32-33
• 4 討論33-34
• 5 小結(jié)34-35
• 第二章 HTRA上調(diào)表達(dá)菌株和下調(diào)表達(dá)菌株蛋白表達(dá)譜的差異分析35-62
• 1 材料與儀器試劑35-37
• 1.1 主要儀器與應(yīng)用軟件35-36
• 1.2 常用溶液的配制36-37
• 2 方法37-41
• 2.1 周間質(zhì)蛋白培養(yǎng)時間的選擇及雙向樣品的制備37
• 2.2 外膜蛋白樣品制備[66]37-38
• 2.3 全菌蛋白樣品制備[67]及蛋白定量38-39
• 2.4 蛋白的純化39
• 2.5 雙向電泳39-41
• 2.6 膠內(nèi)酶切41
• 2.7 蛋白差異點的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)分析41
• 3 結(jié)果分析41-56
• 3.0 周間質(zhì)蛋白培養(yǎng)時間的確選擇結(jié)果41-43
• 3.1 周間質(zhì)蛋白 37℃和 30℃條件下蛋白表達(dá)譜比較43-45
• 3.2 外膜蛋白 37℃條件下雙向電泳45-46
• 3.3 全菌蛋白 37℃條件下雙向電泳46-48
• 3.5 htrA上調(diào)表達(dá)株與下調(diào)表達(dá)株誘導(dǎo)前后差異蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果48-56
• 4 討論56-61
• 4.1 周間質(zhì)蛋白56-59
• 4.2 外膜蛋白59-60
• 4.3 半乳糖代謝相關(guān)蛋白60-61
• 5 小結(jié)61-62
• 第三章 HTRA潛在修飾位點的尋找62-71
• 1 材料試劑62
• 2 方法62-64
• 2.1 HtrA兩個蛋白點的分離62
• 2.2 三步萃取法膠內(nèi)取點62-63
• 2.3 LC-MS/MS質(zhì)譜及數(shù)據(jù)分析63
• 2.4 HtrA點突變株的構(gòu)建63-64
• 2.5 點突變體的雙向電泳64
• 3 結(jié)果分析64-68
• 3.1 HtrA兩個蛋白點的分離64-65
• 3.2 LC-MS/MS分析兩個蛋白點65-67
• 3.3 HtrA點突變體的雙向電泳67-68
• 4 討論與小結(jié)68-71
• 4.1 討論68-70
• 4.2 小結(jié)70-71
• 總結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 附錄Ⅰ 各種試劑盒的使用說明書77-80
• 附錄Ⅱ 反應(yīng)體系80-81
• 附錄Ⅲ 實驗中所用常規(guī)儀器列表81-82
• 綜述：HTRA蛋白的研究進(jìn)展82-89
• 參考文獻(xiàn)84-89
• 個人簡歷89-90
• 致謝90-91

【相似文獻(xiàn)】

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9 李月s，

本文編號：359902