本文關(guān)鍵詞：以斑馬魚為模式動物研究轉(zhuǎn)錄因子Irf8及Pu.1在髓系白血病發(fā)生過程中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單核細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)和多形核吞噬細(xì)胞(粒細(xì)胞)的發(fā)育異�？赡軐�(dǎo)致嚴(yán)重的髓系疾病,如骨髓異常增生性疾病,更嚴(yán)重的可導(dǎo)致髓系白血病的發(fā)生。髓系白血病的主要特征是處在不同發(fā)育階段的髓系細(xì)胞異常增生,眾多研究結(jié)果已經(jīng)報道了腫瘤抑制基因突變、原癌基因活化等因素可導(dǎo)致這一疾病的發(fā)生,與此同時,轉(zhuǎn)錄因子(如IRF8、PU.1)等也在其中扮演著非常重要的角色。在髓系細(xì)胞譜系分化過程中,干擾素調(diào)節(jié)因子8(IRF8)的作用尤為重要,它的缺失可導(dǎo)致粒細(xì)胞的異常增生以及巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的大量減少。同樣的,在髓系白血病發(fā)生過程中IRF8也扮演著很重要的作用。研究表明,在小鼠中敲除Irf8會導(dǎo)致一個類似于慢性髓系白血病癥狀的發(fā)生,在慢性(CML)和急性(AML)的病人中,IRF8表達下調(diào),這暗示著它可能是一個致病因子,與此同時,IRF8表達的下調(diào)對于BCR-ABL誘導(dǎo)的CML的發(fā)生是必需的。因此,在髓系白血病發(fā)生過程中,IRF8通常被視為一個腫瘤抑制因子。然而遺憾的是,對于IRF8在髓系細(xì)胞發(fā)育以及白血病發(fā)生過程中的確切作用機制,仍然知之甚少。PU.1,是ETS家族中的一員,也是另一個對于髓系細(xì)胞及白血病發(fā)生起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。一般情況下,IRF8通過IRF關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域與PU.1協(xié)同作用于髓系細(xì)胞發(fā)生,與此同時,它們還可以調(diào)控p15mk4b的表達,p15ink4b是一個非常重要的細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白激酶抑制劑,在AML中常常失去活性。因此,這三者在白血病發(fā)生過程中可能協(xié)同作用,但遺憾的是,在活體內(nèi)關(guān)于它們功能和聯(lián)系的研究仍然較少,這可能歸咎于Pu.1突變小鼠的致死性,從而無法得到Pu.1與Irf8的雙突變純合子小鼠,以研究它們在生物體內(nèi)的相互作用。近年來,斑馬魚(Danio rario)已經(jīng)成為一種重要的模式生物,因其適合大規(guī)模遺傳突變及藥物篩選,用其研究髓系細(xì)胞發(fā)生以及構(gòu)建白血病發(fā)生模型已經(jīng)成為熱點。在斑馬魚中,髓系細(xì)胞在多個造血過程中產(chǎn)生,研究已經(jīng)報道了在原始造血過程中,Irf8作為Pu.1下游的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控髓系前體細(xì)胞的命運決定,然而,在永久造血及成年斑馬魚中它們的功能還尚未被細(xì)致研究。本研究通過TALENs技術(shù)獲得了irf8的幾個突變純合子,在突變體中,不論是在幼魚還是在成魚階段,巨噬細(xì)胞都顯著減少,這表明Irf8對于巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生和維持都是必需的。通過細(xì)胞周期分析及凋亡檢測實驗,發(fā)現(xiàn)Irf8緊密調(diào)控髓系細(xì)胞增殖和凋亡,因此,成年irf8-/-快就可以表現(xiàn)出類似于骨髓增生異常的癥狀,隨著時間推移,這種癥狀會越來越嚴(yán)重并出現(xiàn)高死亡率,而移植實驗證明了它類似于髓系白血病的癥狀。這是首次通過內(nèi)源基因敲除而在斑馬魚上構(gòu)建的第一個髓系白血病模型,為在斑馬魚上進一步研究髓系白血病的發(fā)生提供了一個很好的工具。此外,通過使用一種白血病臨床治療藥物拓?fù)涮婵?很大程度上降低了突變體中異常增生的粒細(xì)胞的數(shù)目。因此,rf8△57/△57也許可以作為一個很好的模型用于篩選與髓系細(xì)胞發(fā)育調(diào)控及白血病治療有關(guān)的藥物。與此同時,在構(gòu)建的irf8與pu.1的雙突變純合子irf8△57/△57/pu.1G242D/G242D中,粒細(xì)胞的浸潤相較irf8突變體更嚴(yán)重,同時在肝臟和腸道中出現(xiàn)許多大量堆積的壞死的白細(xì)胞,這提示在雙突變體中,肝臟和腸道的功能可能已經(jīng)發(fā)生異常,而這與我們觀察到其相較irf8變體而言出現(xiàn)的超高死亡率相一致。然而非常奇怪的是,在雙突變體中,blast細(xì)胞的數(shù)目反而降低了,這可能意味著在髓系白血病發(fā)生過程中,Pu.1和Irf8扮演著不同角色。此外,我們還進行了ENU篩選,以期獲得與髓系細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的突變體。我總共篩選得到了8個突變體,非常幸運的是,其中有一個irf8的突變體,它的起始密碼子“ATG”突變成了“ACG”,從而喪失了功能。對其進行表型分析,顯示其與通過TALENs技術(shù)得到的突變體表型類似,都出現(xiàn)了粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的發(fā)育異常。
【關(guān)鍵詞】：irf8 pu.1 斑馬魚 髓系白血病發(fā)生
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7;R-332
【目錄】：

• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 第一部分：文獻綜述12-19
• 1.1 髓系白血病12-13
• 1.2 斑馬魚的造血過程13-14
• 1.3 IRF8和PU.1調(diào)控髓系細(xì)胞發(fā)育的研究進展14-15
• 1.4 TALENs介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)15-17
• 1.5 ENU介導(dǎo)的正向遺傳突變篩選17-19
• 第二部分：材料與方法19-40
• 2.1 實驗動物19
• 2.2 試劑、耗材和儀器19-21
• 2.2.1 主要試劑19-21
• 2.2.2 主要耗材21
• 2.2.3 主要儀器21
• 2.3 試劑配方21-24
• 2.3.1 LB培養(yǎng)基21-22
• 2.3.2 原位雜交相關(guān)試劑22-23
• 2.3.3 抗生素溶液23
• 2.3.4 大腸桿菌E.coli化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備相關(guān)試劑23
• 2.3.5 HE染色液配制23-24
• 2.3.6 其他溶液24
• 2.4 基因組DNA提取24
• 2.5 目的基因片段擴增—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)24-25
• 2.6 PCR產(chǎn)物純化25
• 2.7 突變體irf8~(△57/△57)及pu.1~(G242D/G242D)的鑒定25-26
• 2.8 全胚total RNA提取26-27
• 2.9 成年斑馬魚腎臟血血液細(xì)胞total RNA提取27
• 2.10 cDNA第一條鏈合成27
• 2.11 實時熒光定量PCR27-28
• 2.12 大腸桿菌E.coli化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備28-29
• 2.13 體外合成mRNA29-30
• 2.14 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與擴增30-31
• 2.15 反義RNA探針的制備31-32
• 2.15.1 線性化模板31
• 2.15.2 反義RNA探針的合成和純化31-32
• 2.16 胚胎顯微注射32-33
• 2.17 蘇丹黑B染色33
• 2.18 中性紅染色33
• 2.19 全胚免疫熒光化學(xué)33-34
• 2.20 全胚RNA原位雜交34-35
• 2.21 全胚TUNEL實驗35-36
• 2.22 胚胎活體AO(Acridine Orange)染色36
• 2.23 成年斑馬魚腎臟血血液細(xì)胞提取36
• 2.24 成年斑馬魚外周血血液細(xì)胞涂片制備36
• 2.25 成年斑馬魚腎臟血血液細(xì)胞涂片制備36-37
• 2.26 吉姆薩染色37
• 2.27 成年斑馬魚腎臟血血液細(xì)胞移植37
• 2.28 石蠟切片制備37-38
• 2.29 石蠟切片HE(蘇木精—伊紅)染色38
• 2.30 石蠟切片熒光免疫組織化學(xué)38-39
• 2.31 石蠟切片TUNEL與抗體共染39-40
• 第三部分：實驗結(jié)果40-63
• 3.1 通過TALENs技術(shù)獲得irf8突變體40-42
• 3.1.1 突變位點的選擇與TALENs質(zhì)粒構(gòu)建40
• 3.1.2 irf8突變體產(chǎn)生與篩選鑒定40
• 3.1.3 irf8突變體蛋白穩(wěn)定性檢測40-42
• 3.2 原始造血過程中irf8突變體的表型分析42-43
• 3.3 胚胎發(fā)育的永久造血過程中irf8突變體表型分析43-46
• 3.4 irf8突變體中microglia缺失導(dǎo)致胚胎早期CNS中凋亡細(xì)胞顯著增多46-48
• 3.5 irf8調(diào)控斑馬魚幼魚時期的髓系細(xì)胞增殖48-50
• 3.6 Irf8缺失導(dǎo)致成年斑馬魚表現(xiàn)出類似CML的癥狀50-54
• 3.6.1 irf8突變成魚血相分析50-51
• 3.6.2 irf8突變體粒細(xì)胞在組織器官中大量浸潤51-53
• 3.6.3 irf8突變體腎臟血細(xì)胞移植實驗53-54
• 3.7 Irf8作為腫瘤抑制因子調(diào)控髓系細(xì)胞增殖和凋亡54-56
• 3.8 在雙突變體irf8~(157/△57)/pu.1~(G242D/G242D)中不成熟的粒細(xì)胞大量增生56-58
• 3.8.1 雙突變體irf8~(△57/△57)/pu.1~(G242D/G242D)的獲得及存活率追蹤56
• 3.8.2 雙突變irf8~(△57/△57)/pu.1~(G242D/G242D)成魚血相分析56-58
• 3.8.3 雙突變irf8~(△57/△57)/pu.1~(G242D/G242D)幼魚髓系細(xì)胞分析58
• 3.9 irf8突變體背景上pu.1功能缺陷會導(dǎo)致髓系細(xì)胞大量浸潤及器官異常58-60
• 3.10 ENU遺傳突變篩選得到irf8的點突變體60-63
• 3.10.1 ENU篩選得到microglia發(fā)育缺陷/異常的突變體60-62
• 3.10.2 V5-2突變體突變位點鑒定62-63
• 第四部分：討論與分析63-65
• 參考文獻65-69
• 附錄69-71
• 致謝71-72
• 在讀期間發(fā)表的文章72-73
• 在讀期間參加研究課題情況73

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1 張立鳳;鐘濤;桂永浩;;外源性視黃酸對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響[J];中國實驗動物學(xué)報;2006年02期

2 何秋霞;劉可春;楚杰;王思鋒;韓利文;王希敏;;斑馬魚作為模式生物在心血管疾病研究中的應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2009年05期

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本文編號：350099