本文關(guān)鍵詞：家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)手足口病疫苗EV71的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶(Bombyx mori)是一種被馴化和利用5000年之久的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng),在我國(guó)農(nóng)業(yè)、工業(yè)及科學(xué)研究中都占有重要的地位。絲腺是家蠶合成和分泌絲蛋白的特化器官,絲蛋白在五齡后期隨核內(nèi)有絲分裂大量合成,以絲狀物形式高效分泌出來(lái),結(jié)成一個(gè)重約0.5g的蠶繭。由于具有高效的蠶絲生產(chǎn)能力,加之飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn),家蠶成為合成和生產(chǎn)外源蛋白的理想生物反應(yīng)器。近年來(lái),整個(gè)亞太地區(qū),特別在中國(guó)手足口病(Hand, foot and mouth disease,HFMD)的爆發(fā)和流行,嚴(yán)重威脅著這一地區(qū)嬰幼兒的健康。目前針對(duì)此病還沒(méi)有特別有效的治療藥物,亟需開(kāi)發(fā)一種抗原譜廣、免疫原性高、安全穩(wěn)定的疫苗,是預(yù)防這一疾病的根本措施。本論文利用含有piggyBac轉(zhuǎn)座子基礎(chǔ)元件的原始質(zhì)粒,構(gòu)建了中部絲腺組織與時(shí)空特異表達(dá)手足口病疫苗的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒,采用胚胎顯微注射技術(shù),經(jīng)過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性品系。為了提高外源蛋白的分離純化效率,通過(guò)獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶品系與絲膠繭突變體Nd-s品系雜交和篩選,我們得到了絲膠繭陽(yáng)性品系。從個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和Inverse PCR結(jié)果可知,所轉(zhuǎn)外源基因不影響家蠶幼蟲(chóng)個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育。RT-PCR 和 QPCR的結(jié)果顯示目標(biāo)基因VP1在中部絲腺特異性地高表達(dá)。SDS-PAGE 和 western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明VP1蛋白的成功表達(dá)。在探索VP1蛋白的分離純化條件時(shí),首先通過(guò)陽(yáng)性絲膠繭不同處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn),我們得到絲膠繭的最適處理時(shí)間為60h。然后對(duì)比濃縮過(guò)的正常陽(yáng)性繭和直接提取的絲膠繭的外源蛋白的提取效率,結(jié)果顯示,每個(gè)絲膠繭和正常陽(yáng)性繭中的VP1蛋白分別為41.7gg和9.8μg。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小,首先將上述兩樣品的總蛋白通過(guò)50kd的濃縮柱,再將過(guò)濾液通過(guò)30kd的濃縮柱,如此重復(fù)濃縮純化3-5次,通過(guò)分子篩的原理即可得到比較純凈的VP1蛋白。通過(guò)和BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(1、2和5μg)對(duì)比,SDS-PAGE結(jié)果顯示,每個(gè)絲膠繭和正常陽(yáng)性繭得到目標(biāo)蛋白分別為500ng和550ng,純度分別為90%和70%。后經(jīng)過(guò)ELISA活性檢測(cè),VP1抗原蛋白可以很好地和EV71VLP綜合性抗體和mD5單克隆抗體結(jié)合,顯示出良好的生物活性。以上結(jié)果證明了VP1蛋白成功高效地表達(dá)并分泌到絲膠繭中。為了提高VP1外源蛋白的表達(dá)量,我們嘗試?yán)肅RISPR/Cas9介導(dǎo)的定點(diǎn)整合技術(shù)將VP1和紅色熒光蛋白的表達(dá)框序列定點(diǎn)插入到sericin1基因的翻譯起始位點(diǎn),然后借助serl基因內(nèi)源啟動(dòng)子活性以及多線染色體的核內(nèi)有絲分裂高效轉(zhuǎn)錄活性,試圖最大可能地提高外源基因的表達(dá)量。我們構(gòu)建了單、雙靶點(diǎn)兩種類(lèi)型的donor,分別得到GO代蛹期嵌合體20頭和8頭,占蛹總數(shù)的7.14%和5.03%。其中,兩種Donor得到的生殖腺特異的嵌合體占總嵌合體個(gè)數(shù)的比例分別為60%和50%。遺憾的是,這些嵌合體沒(méi)有成功地通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定遺傳的陽(yáng)性品系。Cas9/sgRNA切割效率的檢測(cè),結(jié)果顯示兩個(gè)位點(diǎn)均有活性,但都不高,這可能沒(méi)有得到陽(yáng)性品系的原因。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 VP1 轉(zhuǎn)基因技術(shù) CRlSPR/Cas9 定點(diǎn)整合
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 緒論11-22
• 1.1 引言11
• 1.2 EV71疫苗的研究進(jìn)展11-12
• 1.3 家蠶生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展12-19
• 1.3.1 家蠶核型多角體病毒(BmNPV)表達(dá)系統(tǒng)13
• 1.3.2 piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因遺傳操作系統(tǒng)13-17
• 1.3.3 家蠶絲腺生物反應(yīng)器的存在的問(wèn)題分析和發(fā)展趨勢(shì)17-19
• 1.4 本項(xiàng)目的研究意義、內(nèi)容及技術(shù)路線19-22
• 1.4.1 研究背景與意義19-20
• 1.4.2 研究?jī)?nèi)容20-21
• 1.4.3 技術(shù)路線圖21-22
• 第二章 轉(zhuǎn)基因家蠶介導(dǎo)的EV71疫苗的表達(dá)研究22-49
• 2.1 引言22
• 2.2 材料與試劑22-26
• 2.2.1 家蠶品系及飼養(yǎng)條件22
• 2.2.2 主要藥品、試劑和試驗(yàn)儀器22-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-42
• 2.3.1 轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建26-34
• 2.3.2 體外轉(zhuǎn)錄Helper mRNA(IFP2)34-35
• 2.3.3 家蠶胚胎顯微注射和熒光篩選方法35-36
• 2.3.4 Inverse PCR檢測(cè)插入位點(diǎn)36-37
• 2.3.5 家蠶絲腺RNA提取37
• 2.3.6 RT-PCR和QPCR37-39
• 2.3.7 家蠶活性蛋白的分離純化39-41
• 2.3.8 家蠶活性蛋白的鑒定41-42
• 2.4 結(jié)果分析42-47
• 2.4.1 絲膠繭陽(yáng)性品系獲得42-44
• 2.4.2 VP1基因在家蠶個(gè)體中表達(dá)分析44-45
• 2.4.3 VP1蛋白的分離純化45-47
• 2.4.4 VP1蛋白的活性鑒定47
• 2.5 討論47-48
• 2.6 本章小結(jié)48-49
• 第三章 基于CRISPR/CAS9家蠶基因組編輯技術(shù)的EV71疫苗的表達(dá)研究49-62
• 3.1 引言49
• 3.2 材料與試劑49-50
• 3.2.1 家蠶品系及飼養(yǎng)條件49-50
• 3.2.2 主要藥品、試劑和試驗(yàn)儀器50
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法50-57
• 3.3.1 Donor質(zhì)粒的構(gòu)建方法50-52
• 3.3.2 體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA、Sericin1 sgRNAs和Bmku70 dsRNA52-55
• 3.3.3 家蠶胚胎顯微注射和熒光篩選方法55
• 3.3.4 突變體基因組DNA提取以及突變檢測(cè)55-57
• 3.4 結(jié)果分析57-60
• 3.4.1 基因組整合位點(diǎn)及Donor載體設(shè)計(jì)57
• 3.4.2 蛹期GO代嵌合體紅色熒光的表達(dá)57-58
• 3.4.3 Cas9/sgRNA切割效率的檢測(cè)58-60
• 3.5 討論60-61
• 3.6 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 引用文獻(xiàn)63-68
• 致謝68

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