本文關鍵詞：PTEN調節(jié)的ERK5信號對PC12細胞分化的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景神經細胞再生與分化障礙或退化涉及到許多疾病如老年癡呆、脊髓性肌肉萎縮、亨廷頓舞蹈癥等,PTEN和MAPKs信號在細胞生長與分化過程中起著正負調節(jié)的作用,決定著生存與凋亡、生長與分化間的平衡。作為信號轉導的調節(jié)因子,PTEN是一個重要的磷酸酶也是一個重要的腫瘤抑制因子。自從PTEN在1997年作為一個抑癌基因發(fā)現后,人們對其生物學活性進行了非常廣泛的研究。已知PTEN的一個最重要的活性在于調節(jié)細胞內的生長與增殖信號,抑制過強信號導致的細胞惡性增生,在信號的正負平衡方面,起著負性調節(jié)作用.PTEN不僅對磷脂具有去磷酸化活性,使IP3去磷酸化生成PIP2,抑制PI3K/AK T信號通路的活性。而且對蛋白質也具有去磷酸化作用,已有研究分析表明,PTEN去磷酸化的底物氨基酸殘基既包括絲氨酸和蘇氨酸也包括酪氨酸。最早發(fā)現的PTEN蛋白質底物是FAK(focal adhesion kinase)。因而,PTEN又被稱為雙性磷酸酶。與PTEN對細胞生長的調節(jié)陰性調節(jié)相對應,MAPK家族在促進細胞生長方面屬于陽性調控,在經典MAPK中,ERK5發(fā)現較晚、分子量相對較大,又稱為BMK1,其由816個氨基酸構成,位于氨基末端近一半氨基酸殘基構成了激酶結構域,其羧基末端包括兩個脯氨酸富集區(qū)、一個核定位信號和一個近末端的自動磷酸化區(qū)域。ERK5信號途徑受應激信號、生長因子和細胞因子信號激活。功能范圍主要涉及細胞的生長、分化和調亡。ERK5受MEKK2/3-MEK5級聯(lián)激活,激活后的ERK5轉位到核內,直接激活其他轉錄因子。因此,PTEN在細胞內可能有著廣泛的底物,可能直接或間接調節(jié)ERK5的活性。而PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞株,膜上有NGF受體,受生理水平NGF誘導后,它們停止分裂,長出突起,分化為具有交感神經元特性的細胞,常用于神經系統(tǒng)的體外研究。因此,通過本課題的研究,我們可能在PTEN對ERK5途徑的各組分間對轉錄因子的調控中以及對神經細胞分化相關基因的表達調控中發(fā)現新的治療靶位點,對臨床應用具有很大的意義。目的通過比較確定PTEN作用于Cot/Tpl-MEKK2/3—MEK5—ERK5信號通路的切入點,即PTEN通過哪個分子的去磷酸化,下調這一信號通路的活性。而后,實驗將進一步確定PTEN與靶目標分子間的作用,再利用免疫共沉淀、GST-pulldown重點分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、PTEN與MEK5、PTEN與ERK5間的相互作用,確定PTEN調節(jié)ERK5信號通路的切入點以及PTEN沉默后對PC12細胞分化的影響。方法利用免疫共沉淀重點分析PTEN與COT、PTEN與MEKK2/3、MEK5和ERK5間的相互作用,通過比較確定PTEN作用于Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號通路的切入點;利用慢病毒穩(wěn)定感染技術,通過免疫印記(Western-blot)驗證并檢測PTEN過表達后和沉默后,上、下游各信號分子磷酸化水平的變化,確定PTEN通過去磷酸化哪個分子來下調這一信號通路的活性;再通過體外實驗,原核誘導表達GST-PTEN,然后GST-pulldown PC12細胞裂解液,驗證PTEN作用的靶蛋白,以期確定PTEN調節(jié)Cot/Tpl—MEKK2/3—MEK5—ERK5信號通路對PC12細胞分化的影響;此外,利用Ray Bio人類RTK磷酸化抗體芯片,檢測PTEN過表達和沉默后受體酪氨酸激酶信號通路各因子的相對磷酸化水平,檢測PTEN可能作用的靶蛋白受體,探索可能受PTEN去磷酸化調控的與細胞分化相關的其他信號通路分子。結果在獲得PTEN穩(wěn)定過表達和沉默的HEK 293T細胞系后,通過Western-blot、免疫共沉淀及GST-pulldown發(fā)現,PTEN沉默后,MEK5和ERK5的磷酸化水平增加,且PTEN能與MEK5、ERK5相互作用;通過計數得到的細胞生長曲線,發(fā)現是PTEN沉默后HEK 293T細胞生長速度比PTEN過表達的細胞生長速度快;通過培養(yǎng)PTEN沉默的PC12細胞后發(fā)現相對于正常的PC12突起生長顯著;通過Ray Biotech人類受體酪氨酸激酶磷酸化抗體芯片1檢測,發(fā)現PTEN沉默后,與PTEN沉默對照組相比,有四個因子Eph B3、HGFR、MUSK、VEGFR2磷酸化水平上調,PTEN沉默后與PTEN過表達相比,有兩個因子Insulin R和VEGFR2的表達水平明顯上調。結論1.PTEN通過作用于MEK5間接調節(jié)ERK5活性,并同時直接作用于ERK5調節(jié)Cot/Tpl-MEKK2/3-MEK5-ERK5信號通路;2.PTEN沉默后,能夠促進HEK 293T細胞的增殖;3.PTEN沉默的PC12細胞相對于正常組PC12突起生長顯著;4.Eph B3、HGFR、MUSK、VEGFR2、Insulin R和VEGFR2等受體因子可能是PTEN去磷酸化的靶蛋白受體,這還有待于進一步證實。
【關鍵詞】：PTEN 信號通路 ERK5 細胞分化
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 英文縮略詞表13-15
• 前言15-19
• 1.材料19-25
• 1.1 主要材料試劑19-20
• 1.2 試劑配制20-23
• 1.3 儀器設備23-25
• 2.實驗方法25-39
• 2.1 細胞培養(yǎng)實驗25-26
• 2.1.1 細胞生長條件25
• 2.1.2 細胞復蘇25
• 2.1.3 細胞傳代25
• 2.1.4 細胞凍存25-26
• 2.2 細胞中總RNA的提取及定量26
• 2.3 反轉錄PCR合成CDNA第一鏈26-27
• 2.4 TOP10感受態(tài)細胞的制備27
• 2.5 PTEN-PCDNA3.1(-)質粒和PTEN-PGEX-6P-1 質粒的構建27-31
• 2.5.1 引物設計及目的基因CDS區(qū)擴增27-28
• 2.5.2 膠回收目的基因28-29
• 2.5.3 目的基因兩端加A29
• 2.5.4 連接pGEM-T easy Vector29
• 2.5.5 轉化Top10感受態(tài)進行藍白班篩選29
• 2.5.6 質粒的提取29-30
• 2.5.7 酶切鑒定及測序正確后亞克隆至目的載體pcDNA3.1(-) 和載體pGEX-6p-1.1630-31
• 2.6 慢病毒實驗31-32
• 2.6.1 送公司包裝PTEN過表達和干擾慢病毒31
• 2.6.2 慢病毒滴度檢測實驗31
• 2.6.3 慢病毒感染實驗31-32
• 2.7 測定細胞生長曲線32
• 2.8 人RTK磷酸化抗體芯片檢測32
• 2.9 血清刺激實驗32
• 2.10 WESTERN-BLOT32-35
• 2.10.1 蛋白樣品的收集32-33
• 2.10.2 BCA法測蛋白濃度33
• 2.10.3 Western-blot實驗33-35
• 2.11免疫共沉淀實驗35
• 2.12 GST-PULLDOWN驗證PTEN與MEK5、ERK5的結合35-39
• 3.實驗結果39-53
• 3.1 PTEN-PGEX-6P-1 原核表達質粒和PTEN-PCDNA3.1(-)過表達質粒構建結果39-40
• 3.2 慢病毒感染實驗結果40-41
• 3.3 細胞生長曲線實驗結果41-42
• 3.4 PTEN過表達和沉默后ERK5上游各因子磷酸化水平的檢測42-43
• 3.5 免疫共沉淀實驗結果43-44
• 3.6 PTEN去磷酸化作用WESTERN-BLOT檢測實驗44-46
• 3.7 GST-PTEN優(yōu)化誘導表達及純化實驗結果46-48
• 3.8 GST-pulldown 實驗結果48-49
• 3.9 人RTK磷酸化抗體芯片檢測實驗結果49-53
• 4.討論53-57
• 5.結論57-59
• 參考文獻59-63
• 綜述63-79
• 參考文獻72-79
• 致謝79-81
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文81-82

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