本文關(guān)鍵詞：CD81介導(dǎo)HCV入侵種屬特異性分子基礎(chǔ)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝病的主要誘因,在全世界范圍內(nèi)感染人數(shù)已超過1.7億。由于HCV感染具有高度嚴格的宿主特異性,只有人和黑猩猩可支持HCV感染,HCV小動物模型的研發(fā)成為了阻滯HCV相關(guān)研究,特別是疫苗研發(fā)的瓶頸之一。HCV宿主特異性的基礎(chǔ)來源于病毒入侵過程的復(fù)雜性。目前,已知HCV受體至少包括CD81, SR-B1, Claudin-1 和 Occludin等4種。其中CD81是HCV早期入侵所必須的。CD81直接與HCV-E2相結(jié)合,其介導(dǎo)HCV的入侵具有很強的種屬特異性,只有人和黑猩猩的CD81以很高的親和力結(jié)合HCV-E2并支持HCV入侵,但其分子機制至今尚不明確。為揭示CD81介導(dǎo)HCV入侵種屬特異性分子機制,本課題利用結(jié)構(gòu)生物學,生物物理學和病毒學的方法對人,小鼠,和非洲綠猴的,CD81 (hCD81, mCD81 和 agmCD81)進行了深入的研究。首先解析了hCD81-LEL, mCD81-LEL 和 agmCD81-LEL的高分辨率晶體結(jié)構(gòu),mCD81-LEL和agmCD81-LEL的全局結(jié)構(gòu)與hCD81-LEL類似,均由五個α-螺旋組成“磨菇型”結(jié)構(gòu),螺旋-A/E構(gòu)成了“磨菇莖”,螺旋-B/C/D構(gòu)成了“蘑菇頭”,其中D-helix是CD81直接與HCV-E2結(jié)合的區(qū)域。通過結(jié)構(gòu)對比分析發(fā)現(xiàn),在mCD81-LEL和agmCD81-LEL中188-196氨基酸殘基之間形成了分子內(nèi)氫鍵/鹽鍵,而類似的分子內(nèi)相互作用在hCD81-LEL中是不存在的。之前有研究報道,CD81D-helix構(gòu)象的靈活性是與E2結(jié)合所必須的,而在mCD81-LEL 和 agmCD81-LEL結(jié)構(gòu)中,分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵通過把D-helix錨定在穩(wěn)定的E-helix上,因此我們推測假分子內(nèi)氫鍵/鹽鍵對D-helix的構(gòu)象靈活性產(chǎn)生了束縛作用,從而干擾了CD81與E2的相互作用,削弱了CD81介導(dǎo)HCV入侵效率。以往的研究表明F186是CD81與HCV-E2的結(jié)合所必須的,因此,我們在F186存在的基礎(chǔ)上設(shè)計突變實驗,驗證188-196間氫鍵或鹽鍵對E2結(jié)合以及HCV入侵效率的影響。結(jié)果表明,hCD81中,在F186存在的情況下,如果誘導(dǎo)188-196殘基之間形成氫鍵/鹽鍵,會削弱hCD81與HCV-E2之間的結(jié)合,同時會降低HCV的入侵效率。而對于mCD81 和 agmCD81,在具備L186F突變的前提下,破壞188-196殘基之間的氫鍵/鹽鍵,可以提升HCV的入侵效率。本課題結(jié)果證實,CD81中188-196間分子內(nèi)氫鍵/鹽鍵是決定其與HCV-E2的結(jié)合親和力及其介導(dǎo)HCV入侵效率決定因素之一,此理論不但解釋了CD81介導(dǎo)的HCV入侵種屬特異性分子機制,同時為感染性動物模型的建立提供了篩選的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：HCV入侵 CD81 種屬特異性 小動物模型
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 第1章 引言9-13
• 第2章 實驗材料與方法13-41
• 1. 實驗材料13-17
• 1.1 菌株13
• 1.2 質(zhì)粒13-15
• 1.3 常用試劑和耗材15
• 1.4 常用溶液15-16
• 1.5 常用儀器和設(shè)備16-17
• 2. 實驗方法17-41
• 2.1 基因的克隆與質(zhì)粒構(gòu)建17-22
• 2.1.1 引物設(shè)計18
• 2.1.2 目的基因的擴增18-19
• 2.1.3 PCR產(chǎn)物檢測與回收19-20
• 2.1.4 目的基因與載體的限制性酶切20-21
• 2.1.5 目的基因與載體的連接21-22
• 2.1.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化22
• 2.1.7 克隆鑒定22
• 2.2 定點突變構(gòu)建突變體22-27
• 2.2.1 突變體及引物設(shè)計23-26
• 2.2.2 PCR擴增26-27
• 2.2.3 消化27
• 2.2.4 轉(zhuǎn)化27
• 2.3 目的蛋白表達與純化27-30
• 2.3.1 蛋白表達條件篩選27-28
• 2.3.2 蛋白的大量表達純化28-30
• 2.4 蛋白晶體篩選與優(yōu)化30-32
• 2.4.1 蛋白晶體的初篩30-31
• 2.4.2 蛋白晶體的優(yōu)化31-32
• 2.5 晶體數(shù)據(jù)收集及結(jié)構(gòu)解析32-33
• 2.6 圓二色譜試驗33-35
• 2.7 小角X射線散射試驗35-37
• 2.8 結(jié)合試驗37
• 2.9 病毒入侵試驗37-41
• 2.9.1 構(gòu)建CD81缺陷型Huh7.5.1細胞系38-39
• 2.9.2 擴增HCVpp和HCVcc病毒顆粒39
• 2.9.3 HCVpp感染試驗39-40
• 2.9.4 HCVcc感染試驗40-41
• 第3章 實驗結(jié)果41-60
• 3.1 目的蛋白原核表達與純化41-43
• 3.2 晶體初篩和優(yōu)化43-45
• 3.2.1 結(jié)晶條件初篩結(jié)果43-44
• 3.2.2 結(jié)晶條件優(yōu)化結(jié)果44-45
• 3.3 晶體解析及結(jié)構(gòu)解析45-47
• 3.4 結(jié)構(gòu)分析47-51
• 3.5 圓二色譜試驗51-53
• 3.6 小角散射試驗53-55
• 3.7 結(jié)合試驗55-57
• 3.8 病毒入侵試驗57-60
• 3.8.1 HCVpp入侵試驗57-58
• 3.8.2 HCVcc入侵試驗58-60
• 第4章 討論60-64
• 參考文獻64-68
• 致謝68-70
• 個人簡歷及發(fā)表文章70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馮煒瑋;陳志偉;;蛋白質(zhì)結(jié)晶及其影響因素研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2010年18期

  本文關(guān)鍵詞：CD81介導(dǎo)HCV入侵種屬特異性分子基礎(chǔ)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：327188