本文關(guān)鍵詞：計(jì)算分析皰疹病毒感染引起宿主基因轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組的改變，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Ⅰ型單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus type I,HSV-1)是一種雙鏈線性DNA病毒,基因組全長(zhǎng)152kb,可以編碼80個(gè)蛋白基因,超過(guò)80%的人被HSV-1感染。HSV-1從外周神經(jīng)節(jié)感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)入潛伏期感染。應(yīng)急信號(hào)可以引起HSV-1在感覺(jué)神經(jīng)元重激活,裂解感染確保表皮細(xì)胞神經(jīng)元活化,最終造成唇皰疹,腦膜炎,甚至導(dǎo)致死亡。HSV-1裂解期感染是快速展開(kāi),即早期基因(immediate early,IE)的表達(dá),包括ICP0和ICP4,這些基因的表達(dá)可以立即招募宿主的RNA聚合酶和其他的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,從而促使HSV-1病毒的早期基因的表達(dá),準(zhǔn)備開(kāi)始病毒DNA的合成和晚期基因的表達(dá),而晚期基因是在病毒感染6小時(shí)后才開(kāi)始表達(dá)的。在以上所提及的生物過(guò)程中,病毒可以利用宿主的調(diào)控因子,宿主的反應(yīng)和途徑來(lái)促進(jìn)病毒的復(fù)制。宿主細(xì)胞遭到病毒的入侵后,可以引起許多宿主反應(yīng),比如激活干擾素途徑,DNA損傷反應(yīng),凋亡和其他的抑制病毒增長(zhǎng)的機(jī)制。而病毒基因自身編碼的蛋白因子可以抵抗以上所說(shuō)的宿主反應(yīng),從而確保病毒可以順利地轉(zhuǎn)錄,基因組合成和組裝。比如ICP34.5是干擾INF-β途徑的關(guān)鍵性的病毒因子；ICP27和ICP22是宿主凋亡反應(yīng)的調(diào)控因子,通過(guò)失活A(yù)TR激酶來(lái)抑制DNA損傷反應(yīng)；ICP0通過(guò)在DNA損傷反應(yīng)中替換宿主沉默復(fù)合物CoREST以及降解RNF8和RNF168,從而抑制宿主轉(zhuǎn)錄沉默活性；HSV-1也編碼ICP27來(lái)抑制RNA可變剪接和VHS降解宿主RNAs。盡管已經(jīng)有這些研究進(jìn)展,但是病毒與宿主之間的表觀遺傳相互作用依然不是完全了解。HSV-1在人類表皮細(xì)胞進(jìn)行裂解期感染并且劇烈的改變宿主細(xì)胞核。以前的DNA芯片分析感染的小鼠角膜和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF),揭示廣泛的宿主基因表達(dá)譜的改變。在這里我們通過(guò)高通量測(cè)序RNA-seq,分析了HSV-1感染人類表皮纖維BJ細(xì)胞的RNA-seq,發(fā)現(xiàn)差異基因表達(dá),可變剪接,可變加尾和基因變體變化。與對(duì)照組相比,HSV-1感染后引起978個(gè)上調(diào)基因和61個(gè)下調(diào)基因,同時(shí)造成217個(gè)可變剪接,161個(gè)可變加尾和1827個(gè)基因異構(gòu)體。結(jié)果表明,我們發(fā)現(xiàn)超過(guò)700個(gè)基因的基因異構(gòu)體發(fā)生變化。有意思的是,GO分析揭示,參與神經(jīng)元生成的基因在病毒感染后顯著上調(diào),而在可變剪接,可變加尾和基因異構(gòu)體方面沒(méi)有任何變化,表明可能是由于ICP0的去抑制,造成神經(jīng)元基因顯著上調(diào)。我們找到了許多病毒與宿主相互作用的重要基因,比如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子brd2和cbx4。我們還發(fā)現(xiàn)了108個(gè)基因參與RNA代謝,包括選擇性降解ARE元件細(xì)胞因子zfp36。分析結(jié)果揭示了許多新的參與病毒與宿主相互作用的基因,并且暗示可變剪接和可變加尾作為重要的機(jī)制,在病毒感染的細(xì)胞中產(chǎn)生新的調(diào)控功能。有趣的是,病毒感染引起宿主染色質(zhì)急劇動(dòng)態(tài)重組,比如在全基因組中,將近90%的CTCF在病毒感染后缺失。高度誘導(dǎo)的基因傾向與CTCF相互作用,表明CTCF可能在高度調(diào)控的基因發(fā)揮重要的作用。RNA-seq和RNA Pol II ChIP-seq相比較,我們發(fā)現(xiàn)130個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平被誘導(dǎo),而444個(gè)是在RNA代謝水平被調(diào)控�？傊�,通過(guò)結(jié)合RNA-seq, ChIP-seq,經(jīng)典的病毒學(xué)和基因組學(xué)研究,我們能夠揭示HSV-1感染人類表皮細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳組的重大變化。這些分析給細(xì)胞基因組如何應(yīng)對(duì)急性外部感染,比如裂解期病毒感染,和在基因組水平展開(kāi)的病毒與宿主之間的表觀遺傳作用新的啟示。
【關(guān)鍵詞】：I型單純皰疹病毒 基因差異表達(dá) 可變剪接 可變加尾 異構(gòu)體
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R373.11
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-19
• 1 HSV-1介紹10-12
• 1.1 HSV-1危害10
• 1.2 HSV-1目前研究進(jìn)展10-11
• 1.3 本課題研究目標(biāo)11
• 1.4 本課題科學(xué)價(jià)值和臨床應(yīng)用價(jià)值11-12
• 2 RNA-sequencing12-14
• 2.1 RNA-sequencing測(cè)序技術(shù)方法12
• 2.2 RNA-sequencing優(yōu)勢(shì)與難點(diǎn)12-13
• 2.3 RNA-sequenc數(shù)據(jù)分析一般方法13-14
• 3 ChIP-sequencing14-16
• 3.1 ChIP-sequencing測(cè)序技術(shù)方法14
• 3.2 ChIP-sequencing優(yōu)勢(shì)與難點(diǎn)14
• 3.3 ChIP-sequenc數(shù)據(jù)分析一般方法14-16
• 4 CTCF16-19
• 4.1 CTCF介紹16
• 4.2 CTCF生物功能16-19
• 第二章 HSV-1誘導(dǎo)基因差異表達(dá),可變剪接,可變加尾和異構(gòu)體表達(dá)19-50
• 1 課題的設(shè)計(jì)19
• 2 RNA-seq技術(shù)路線19-20
• 3 材料與方法20-31
• 3.1 主要儀器20
• 3.2 試劑與耗材20-21
• 3.3 主要溶液及其配置21
• 3.4 細(xì)胞與病毒21-22
• 3.4.1 細(xì)胞與病毒的來(lái)源21
• 3.4.2 病毒的擴(kuò)增21-22
• 3.4.3 病毒滴度測(cè)定22
• 3.5 RNA-seq測(cè)序樣品準(zhǔn)備22-25
• 3.5.1 BJ細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 3.5.2 HSV-1感染BJ細(xì)胞23
• 3.5.3 免疫熒光檢測(cè)病毒感染效果23-24
• 3.5.4 RNA提取24-25
• 3.6 RNA-seq數(shù)據(jù)分析25-26
• 3.6.1 基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)分析25
• 3.6.2 基因可變剪接數(shù)據(jù)分析25
• 3.6.3 基因可變加尾數(shù)據(jù)分析25
• 3.6.4 基因異構(gòu)體數(shù)據(jù)分析25-26
• 3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR26-31
• 3.7.1 cDNA合成(用于qRT-PCR)26
• 3.7.2 cDNA合成(用于半定量PCR)26-27
• 3.7.3 引物設(shè)計(jì)和合成27-30
• 3.7.4 熒光定量PCR驗(yàn)證30-31
• 3.7.5 半定量PCR驗(yàn)證31
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-47
• 4.1 HSV-1感染宿主細(xì)胞BJ誘導(dǎo)基因差異表達(dá)32-36
• 4.2 HSV-1感染BJ細(xì)胞導(dǎo)致可變剪接36-39
• 4.3 HSV-1感染BJ細(xì)胞導(dǎo)致可變加尾39-42
• 4.4 HSV-1感染BJ細(xì)胞Isoform表達(dá)42-44
• 4.5 差異表達(dá),可變剪接,可變加尾和異構(gòu)體的GO terms變化產(chǎn)生不同的調(diào)控機(jī)制44-47
• 5 結(jié)論47-50
• 第三章 HSV-1改變CTCF和RNA PolⅡ結(jié)合50-62
• 1 課題的設(shè)計(jì)50
• 2 ChIP-seq技術(shù)路線50-51
• 3 材料與方法51-55
• 3.1 主要儀器51
• 3.2 試劑51
• 3.3 主要溶液及其配置51-53
• 3.4 ChIP-seq測(cè)序樣品準(zhǔn)備53-55
• 3.5 ChIP-seq數(shù)據(jù)分析55
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-60
• 4.1 CTCF結(jié)合變化56
• 4.2 CTCF與基因表達(dá)之間的關(guān)系56-58
• 4.3 HSV-1感染前后RNA polⅡ與RNA-seq關(guān)系58-60
• 5 結(jié)論60-62
• 參考文獻(xiàn)62-74
• 附錄74-75
• 致謝75

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