發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 05:01

  本文關(guān)鍵詞：抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胰島素是生物體內(nèi)非常重要的降糖激素,它是糖尿病診斷、糖尿病相關(guān)研究及糖尿病治療藥物研發(fā)等過程中重要的檢測(cè)指標(biāo)和研究靶點(diǎn)。因此,檢測(cè)胰島素水平是必需的技術(shù)要求。目前,用于檢測(cè)胰島素含量的方法大都基于抗原抗體特異性反應(yīng)的原理,因此制備高效、特異的抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體是建立胰島素檢測(cè)方法的重要基礎(chǔ)。在本研究中,我們制備了抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體,并對(duì)抗體的特性進(jìn)行初步研究,得到以下結(jié)果。1.檢測(cè)抗胰島素抗體水平的間接ELISA方法條件的優(yōu)化。在進(jìn)行陽性克隆篩選前我們要對(duì)測(cè)定抗體水平的間接ELISA方法的條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究中我們分別從抗原包被濃度、小鼠血清稀釋比例、封閉液種類、封閉時(shí)間、血清作用時(shí)間、酶標(biāo)抗體稀釋比例和孵育時(shí)間等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果如下:抗原最佳包被濃度為5μg/mL,小鼠血清最優(yōu)稀釋比例為1:100,最佳封閉液為1%BSA,其最優(yōu)封閉時(shí)間為2 h,血清最佳作用時(shí)間為1.5 h,酶標(biāo)抗體最佳稀釋比例為1:6000,其最優(yōu)作用時(shí)間為30 min。2.抗胰島素單克隆抗體的制備。首先,我們用商品化的豬胰島素作為抗原,采用背部多點(diǎn)注射和腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。三次免疫后,通過間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清效價(jià),優(yōu)先選擇效價(jià)高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。然后在加強(qiáng)免疫后3天處死小鼠,無菌取脾,獲得的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0細(xì)胞或者NS-1細(xì)胞通過化學(xué)試劑聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)融合。本研究中總共進(jìn)行了4次細(xì)胞融合,經(jīng)篩選和亞克隆,最后獲得三株陽性雜交瘤細(xì)胞,分別為2D7、4D4和5D12。經(jīng)Mouse單抗亞型鑒定試劑盒鑒定抗體亞型全為IgM型,輕鏈為Kappa。通過體內(nèi)誘生的方法產(chǎn)生大量單克隆抗體,經(jīng)測(cè)定,2D7、4D4、5D12腹水效價(jià)分別為1:3200、1:51200和1:12800。利用優(yōu)球蛋白純化法得到初純抗體。最后,我們鑒定了抗體的特異性和交叉反應(yīng)性。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,三種單克隆抗體均與牛胰島素發(fā)生交叉反應(yīng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,三種抗體可能識(shí)別胰島素的構(gòu)象性表位,而非線性表位。3.抗胰島素多克隆抗體的制備。我們用商品化的豬胰島素和牛胰島素分別作為抗原,采用背部多點(diǎn)注射和腹腔注射的方式免疫豚鼠。一共免疫4次,最后免疫5天后,采用心臟取血的方法收集大量血清。利用間接ELISA方法測(cè)定血清效價(jià),抗原為豬胰島素的豚鼠血清效價(jià)為1:25600,抗原為牛胰島素的豚鼠血清最高效價(jià)為1:51200。經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后,成功獲得粗純的多克隆抗體。隨后我們鑒定了抗體的特異性和交叉反應(yīng)性。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,抗豬胰島素多克隆抗體能與牛胰島素發(fā)生交叉反應(yīng),且抗牛胰島素多克隆抗體與豬胰島素也能發(fā)生交叉反應(yīng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種多克隆抗體均能與豬胰島素和牛胰島素特異性結(jié)合。綜上所述,我們成功地獲得了3株分泌抗胰島素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其產(chǎn)生的單克隆抗體,同時(shí)也成功地制備出抗胰島素多克隆抗體,并對(duì)抗體特性進(jìn)行了初步研究,為實(shí)驗(yàn)室自行建立胰島素水平的檢測(cè)方法提供基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：胰島素 單克隆抗體 多克隆抗體 ELISA Western blot
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-11
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述11-20
• 一、胰島素及其應(yīng)用11-12
• （一）胰島素的分子結(jié)構(gòu)11
• （二）胰島素的生物學(xué)功能及應(yīng)用11-12
• 二、胰島素檢測(cè)手段12-15
• （一）放射免疫分析法12
• （二）免疫放射分析法12-13
• （三）酶聯(lián)免疫分析法13
• （四）熒光免疫分析法13-14
• （五）化學(xué)發(fā)光免疫分析法14
• （六）其他新型的檢測(cè)技術(shù)14-15
• 三、抗體的研究進(jìn)展及其應(yīng)用15-19
• （一）抗體制備技術(shù)15-17
• （二）抗體研究進(jìn)展17-18
• （三）抗體的應(yīng)用18-19
• 四、本課題研究的目的與意義19-20
• 第二部分 材料與方法20-32
• 一、實(shí)驗(yàn)材料20-25
• （一）實(shí)驗(yàn)儀器及器材20
• （二）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系20
• （三）實(shí)驗(yàn)試劑20-21
• （四）主要溶液配制21-25
• 二、實(shí)驗(yàn)方法25-32
• （一）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法25
• （二）間接ELISA25-26
• （三）抗胰島素單克隆抗體制備26-28
• （四）抗胰島素多克隆抗體制備28-29
• （五）SDS-PAGE電泳分離和考馬斯亮藍(lán)染色29-30
• （六）抗體特性鑒定30-32
• 第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-48
• 一、不同物種來源的胰島素蛋白質(zhì)序列對(duì)比32-33
• 二、檢測(cè)抗體水平的間接ELISA方法條件的優(yōu)化33-37
• （一）檢測(cè)抗胰島素單抗的間接ELISA方法最佳工作條件的確立33-36
• （二）檢測(cè)抗胰島素多抗的間接ELISA方法最佳工作條件的確立36-37
• 三、抗胰島素單克隆抗體制備37-44
• （一）小鼠加強(qiáng)免疫前小鼠血清效價(jià)測(cè)定37-38
• （二）細(xì)胞融合38-39
• （三）陽性克隆檢測(cè)、篩選及亞克隆39-41
• （四）單抗亞型鑒定41
• （五）單抗腹水制備及效價(jià)檢測(cè)41-42
• （六）單抗純化42-43
• （七）單抗交叉反應(yīng)性分析43-44
• 四、抗胰島素多克隆抗體制備44-48
• （一）免疫動(dòng)物血清效價(jià)測(cè)定44-45
• （二）多抗純化45
• （三）多抗純化后效價(jià)測(cè)定45-46
• （四）多抗交叉反應(yīng)性分析46-48
• 第四部分 討論48-52
• 第五部分 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-58
• 英文縮寫詞58-59
• 致謝59-60
• 作者簡(jiǎn)介60

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 傅誠強(qiáng);胰島素抵抗和擇期性手術(shù)[J];國外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊(cè);2001年03期

2 賈偉平;中國人群胰島素抵抗的狀況[J];國外醫(yī)學(xué).內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè);2002年04期

3 寧光;李長(zhǎng)貴;洪潔;湯正義;李果;龔艷春;彭怡文;郭冀珍;沈衛(wèi)峰;商淑華;羅邦堯;陳家倫;;胰島素抵抗基礎(chǔ)和臨床研究[J];醫(yī)學(xué)研究通訊;2002年11期

4 姚小皓,沈凱,李學(xué)軍;胰島素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的影響[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2003年01期

5 柯紅林;;2型糖尿病中胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊(cè));2003年03期

6 常桂娟;胰島素抵抗的環(huán)境因素[J];現(xiàn)代診斷與治療;2004年02期

7 米杰 ,張力;胰島素抵抗[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年04期

8 王繼旺,張素華,任偉,杜娟,陳靜,包柄楠,汪志紅,苗青;吸煙與胰島素抵抗的相關(guān)性調(diào)查與分析[J];中國公共衛(wèi)生;2004年08期

9 陽柳雪;劉紅;;可溶性腫瘤壞死因子受體2與胰島素抵抗[J];中國醫(yī)學(xué)文摘.內(nèi)科學(xué);2004年01期

10 康艷明;陽躍忠;;胰島素抵抗與缺血性心腦血管病變[J];中國醫(yī)學(xué)文摘.內(nèi)科學(xué);2004年02期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳艷秋;宗敏;華莉;李臻;肖菲;孫建琴;;2型糖尿病患者肝臟脂肪與胰島素抵抗的關(guān)系[A];中國營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)老年?duì)I養(yǎng)分會(huì)第七次全國營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)交流會(huì)“營(yíng)養(yǎng)與成功老齡化”暨國家級(jí)繼續(xù)教育項(xiàng)目“神經(jīng)系統(tǒng)疾病醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)治療”資料匯編[C];2010年

2 陳艷秋;陳敏;宗敏;華莉;李臻;張?chǎng)我?孫建琴;;2型糖尿病患者肝臟脂肪分布與胰島素抵抗[A];老年?duì)I養(yǎng)研究進(jìn)展與老年?duì)I養(yǎng)供餐規(guī)范研討會(huì)暨糖尿病腎病醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)治療進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2011年

3 宋曉敏;耿秀琴;郭長(zhǎng)磊;;胰島素抵抗幾個(gè)相關(guān)因素在公安人群中的狀態(tài)與分析[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

4 游捷;陳瑤;黃培基;林哲章;;血清可溶性腫瘤壞死因子受體與胰島素抵抗的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

5 謝彬;陳上云;郭堅(jiān);劉薇;勞干誠;;監(jiān)測(cè)真胰島素觀察胰島素抵抗與胰島素敏感性[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

6 尹義輝;王經(jīng)武;;消胰抗治療胰島素抵抗的臨床研究[A];第七次全國中醫(yī)糖尿病學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2003年

7 呂圭源;劉賽月;;中藥抗胰島素抵抗研究進(jìn)展[A];浙江省2005年中藥學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

8 王曉靜;劉正齊;;一種簡(jiǎn)便實(shí)用且較準(zhǔn)確評(píng)估胰島素抵抗的新方法[A];全國中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

9 白秀平;李宏亮;楊文英;肖建中;王冰;杜瑞琴;樓大鈞;;脂肪分存順序與肝臟及肌肉胰島素抵抗的關(guān)系[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)第十次全國糖尿病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

10 孫勤;李伶;楊剛毅;歐陽凌云;陳渝;劉華;唐毅;Gunther Boden;;小鼠擴(kuò)展胰島素鉗夾術(shù)的建立[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)第十次全國糖尿病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;胰島素小常識(shí)[N];保健時(shí)報(bào);2004年

2 ;胰島素抵抗，怎么辦？[N];解放日?qǐng)?bào);2004年

3 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院老年病科副教授 陳化;什么是“胰島素抵抗”[N];健康報(bào);2001年

4 張家慶 （教授）;適度鍛煉身體改善胰島素抵抗[N];上海中醫(yī)藥報(bào);2003年

5 本報(bào)記者 韓曉英;注射胰島素會(huì)成癮嗎[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2002年

6 張怡梅 劉 斌;惡性腫瘤與胰島素抵抗[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2003年

7 健康時(shí)報(bào)特約記者 陳錦屏;胖人易發(fā)“胰島素抵抗”[N];健康時(shí)報(bào);2007年

8 殳雪怡;胰島素抵抗 有辦法“抵抗”嗎[N];家庭醫(yī)生報(bào);2007年

9 劉文山;胰島素抵抗[N];家庭醫(yī)生報(bào);2007年

10 孟懷東;“致命四重奏”與胰島素抵抗[N];中國醫(yī)藥報(bào);2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 殷青青;胰島素抵抗大鼠腦組織損傷機(jī)制以及番茄紅素的保護(hù)作用研究[D];山東大學(xué);2015年

2 施琳穎;二氫楊梅素通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬改善骨骼肌胰島素抵抗的作用及其機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 隆敏;下丘腦室旁核神經(jīng)肽Y長(zhǎng)期過表達(dá)誘導(dǎo)外周胰島素抵抗作用機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 黃文輝;高胰島素抑制腎臟尿酸排泄的基礎(chǔ)與臨床研究以及氯沙坦的干預(yù)機(jī)制[D];蘭州大學(xué);2015年

5 付鋒;缺血后心肌胰島素抵抗促發(fā)缺血性心力衰竭及其機(jī)制[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 王宗保;NO-1886對(duì)糖脂代謝的影響及機(jī)制研究[D];南華大學(xué);2014年

7 張真穩(wěn);小檗堿協(xié)同甘丙肽降低2型糖尿病鼠脂肪組織胰島素抵抗的實(shí)驗(yàn)研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

8 汪心安;IRF9對(duì)小鼠非酒精性脂肪肝和胰島素抵抗的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D];武漢大學(xué);2013年

9 鄭濤;紅景天苷改善胰島素抵抗的作用及其機(jī)制[D];華中科技大學(xué);2015年

10 陳茜;Betatrophin與胰島素抵抗的相關(guān)性及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李晨;辛伐他汀、胰島素聯(lián)合用藥對(duì)糖尿病大鼠下頜骨骨折愈合的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 賈曉嬌;血清Vaspin、u樗�、脂联素灾R焉鍰悄蠆』頰咧興郊?jí)坞淫o核氐摯溝墓叵礫D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

3 黃聲;胰島素抵抗與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 牛尚梅;骨骼肌PGC-1α在高脂導(dǎo)致的胰島素抵抗中的作用機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 安雨;血清視黃醇結(jié)合蛋白-4與2型糖尿病及肥胖的相關(guān)性研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 陳旭;高胰島素水平導(dǎo)致肥胖相關(guān)機(jī)制研究[D];鄭州大學(xué);2015年

7 劉晨曦;津力達(dá)改善棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗的機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 唐明敏;桑葉降糖有效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

9 華玉琢;2型糖尿病相關(guān)醫(yī)學(xué)論文翻譯實(shí)踐報(bào)告[D];哈爾濱師范大學(xué);2016年

10 熊筱璐;HGF/C-Met系統(tǒng)改善胰島素抵抗中的作用以及相關(guān)機(jī)制的研究[D];南京大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：抗胰島素單克隆抗體和多克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：312442