本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌毒力調(diào)控蛋白SarV、SarX和RNA酶J1、J2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)菌感染是導(dǎo)致人類各種疾病的重要原因。但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌的抗藥性也越來越嚴(yán)重。金黃色葡萄球菌是一種在醫(yī)院和社區(qū)中廣泛存在的條件致病菌,其感染能導(dǎo)致食物中毒、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合癥等嚴(yán)重疾病。由于它對(duì)包括萬古霉素在內(nèi)的幾乎所有抗生素的耐藥性,金黃色葡萄球菌感染的發(fā)病率和死亡率一直高居不下,已經(jīng)成為危害人類健康的一個(gè)非常嚴(yán)重的問題。 金黃色葡萄球菌感染一般從傷口擴(kuò)散到血液,進(jìn)一步侵染到宿主的不同組織。進(jìn)入組織后,金黃色葡萄球菌會(huì)產(chǎn)生大量毒力因子,包括細(xì)菌表面相關(guān)蛋白、酶、外毒素、莢膜多糖及能進(jìn)行組織定位、組織破壞和免疫逃避的基因產(chǎn)物。這類毒力基因的表達(dá)受調(diào)控基因的調(diào)控,比如雙組份調(diào)控系統(tǒng)(agr、saeRS、srrAB、 arlRS)和全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)(sarA、sigB、sarA同系物、tcaRA等)。SarV和SarX就是全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)中的一員,對(duì)于細(xì)菌的侵染和毒力調(diào)控非常重要。我們希望通過解析SarV和SarX的晶體結(jié)構(gòu)及其與DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu),了解其與DNA結(jié)合機(jī)制從而進(jìn)一步了解它們對(duì)毒力因子表達(dá)的調(diào)控機(jī)制,為抗菌藥物的研發(fā)提供線索。 RNA的降解過程需要受到嚴(yán)格的調(diào)控,從而保證降解過程是有序和協(xié)調(diào)的。雖然RNA降解體在組成上不保守,在進(jìn)化上也沒有共同的祖先,但在不同的細(xì)菌中都能發(fā)現(xiàn)降解體的存在,這暗示了RNA降解體在細(xì)菌的RNA代謝過程中扮演著重要角色。金黃色葡萄球菌中RNA降解體包含enolase、pfkA、PNPase、 RNase J1、RNase J2、RNase Y、CshA等多種組分,其中RNA降解主要由RNaseJ1和RNase J2來完成。雖然人們對(duì)RNA的降解已經(jīng)進(jìn)行了較多的研究,但是RNA降解體的裝配過程以及各成員之間的相互作用機(jī)制卻并不清楚。我們希望通過對(duì)RNase J1和J2的結(jié)構(gòu)和功能的研究,揭示其在金黃色葡萄球菌RNA降解體中的作用機(jī)理。 我們對(duì)SarX和SarV進(jìn)行了表達(dá)純化與晶體篩選,收集了野生型SarV蛋白晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù)；也得到了可用于結(jié)構(gòu)解析的硒代SarX蛋白晶體的X-射線衍射數(shù)據(jù),確定了SarX晶體結(jié)構(gòu)的相位并初步解析了其結(jié)構(gòu)；表達(dá)純化了RNase J1和J2并進(jìn)行了晶體篩選,在多個(gè)條件下得到了晶體并得到了一套衍射分辨率為3.7A的X-射線衍射數(shù)據(jù),驗(yàn)證了RNase J1與J2的相互作用,檢測(cè)了RNase J1與RNA降解體亞基PNPase和CshA的相互作用。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 自溶 毒力因子 RNA降解體 晶體 X-射線衍射
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.11
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-11
• 第一篇 金黃色葡萄球菌毒力調(diào)控因子SarX和SarV的研究進(jìn)展11-25
• 第一章 綜述11-21
• 1.1.1 金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)介11
• 1.1.2 致病機(jī)制11-12
• 1.1.3 SarA蛋白家族分類12
• 1.1.4 agr基因的激活與調(diào)控12
• 1.1.5 agr基因相關(guān)的其他調(diào)控因子12-13
• 1.1.6 SarA蛋白家族成員與功能13-15
• 1.1.7 SarA蛋白家族各成員介紹15-18
• 1.1.7.1 SarA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能15-17
• 1.1.7.2 SarA蛋白家族與DNA結(jié)合模式17
• 1.1.7.3 SarA蛋白家族其他成員簡(jiǎn)介17-18
• 1.1.8 SarV蛋白的發(fā)現(xiàn)與功能研究18
• 1.1.9 SarX蛋白的發(fā)現(xiàn)及其生物功能18-20
• 1.1.10 本章小結(jié)20-21
• 參考文獻(xiàn)21-25
• 第二篇 SarV蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究25-47
• 第一章 材料與方法25-36
• 2.1.1 儀器設(shè)備25
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑25-26
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基26-27
• 2.1.4 SarV表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建27-30
• 2.1.5 SarV蛋白可溶表達(dá)篩選30-31
• 2.1.6 野生型SarV蛋白的大量表達(dá)31
• 2.1.7 野生型SarV蛋白的純化31-32
• 2.1.8 硒代SarV蛋白的表達(dá)純化32
• 2.1.9 野生型和硒代SarV蛋白結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化32-33
• 2.1.10 野生型SarV蛋白晶體X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集和處理33-34
• 2.1.11 SarV蛋白晶體浸泡重原子的X-射線衍射數(shù)據(jù)收集和處理34
• 2.1.12 晶體結(jié)構(gòu)解析34-36
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論36-47
• 2.2.1 SarV蛋白全長表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建36
• 2.2.2 野生型SarV蛋白的表達(dá)、純化和晶體篩選36-38
• 2.2.3 SarV蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)38-39
• 2.2.4 SarV截短體蛋白的表達(dá)、純化和晶體篩選39-40
• 2.2.5 SarV全長蛋白的晶體篩選和優(yōu)化40-41
• 2.2.6 SarV全長蛋白晶體X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集和處理41-42
• 2.2.7 SarV蛋白晶體泡重原子的X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集和處理42-43
• 2.2.8 硒代SarV蛋白的表達(dá)、純化和晶體篩選43-45
• 2.2.9 本章小結(jié)45-47
• 第三篇 SarX蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究47-63
• 第一章 材料與方法47-51
• 3.1.1 儀器設(shè)備47
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑47
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基47
• 3.1.4 SarX表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建47-48
• 3.1.5 SarX蛋白可溶表達(dá)篩選48
• 3.1.6 野生型SarX蛋白的表達(dá)48-49
• 3.1.7 野生型sarX蛋白的純化49
• 3.1.8 硒代sarX蛋白的表達(dá)純化49
• 3.1.9 野生型和硒代SarX蛋白結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化49
• 3.1.10 野生型和硒代SarX蛋白晶體X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集和處理49-50
• 3.1.11 晶體結(jié)構(gòu)解析50-51
• 第二章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論51-62
• 3.2.1 SarX蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建51
• 3.2.2 SarX全長蛋白的表達(dá)和純化51-52
• 3.2.3 SarX全長蛋白的晶體生長52-53
• 3.2.4 SarX野生型蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)53-54
• 3.2.5 SarX截短體蛋白的表達(dá)、純化和晶體篩選54-56
• 3.2.6 晶體X-射線衍射數(shù)據(jù)的收集與處理56-57
• 3.2.7 晶體結(jié)構(gòu)解析與初步分析57-60
• 3.2.8 本章小結(jié)60-62
• 參考文獻(xiàn)62-63
• 第四篇 金黃色葡萄球菌RNase J1和J2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究63-91
• 第一章 緒論63-72
• 4.1.1 RNA降解體概述63-65
• 4.1.2 調(diào)控RNA穩(wěn)定性的核酸酶分類65-67
• 4.1.3 大腸桿菌核酸內(nèi)切酶RNaseE結(jié)構(gòu)與功能分析67-68
• 4.1.4 枯草芽孢桿菌RNA降解體組成68-69
• 4.1.5 RNA降解體成員RNase J1和J269-70
• 4.1.6 金黃色葡萄球菌RNA降解體簡(jiǎn)介70-71
• 4.1.7 本章小結(jié)71-72
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料和方法72-77
• 4.2.1 RNase J1和J2質(zhì)粒的構(gòu)建72-73
• 4.2.2 蛋白的表達(dá)和純化73-74
• 4.2.3. RNase J1和J2共表達(dá)、共純化和共結(jié)晶74
• 4.2.4 RNase J1和J2蛋白的結(jié)晶條件篩選74
• 4.2.5 晶體的優(yōu)化74-75
• 4.2.6 RNase J1和J2的GST-pulldown實(shí)驗(yàn)75-76
• 4.2.7 RNase J1和PNPase,CshA蛋白的GST-pulldown實(shí)驗(yàn)76-77
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論77-87
• 4.3.1 RNase J1和J2的質(zhì)粒構(gòu)建與小量表達(dá)77
• 4.3.2 RNase J1的純化77-78
• 4.3.3 RNase J2的純化78-79
• 4.3.4 RNase J1和J2相互作用驗(yàn)證79-80
• 4.3.5 RNase J1和J2的共純化和共表達(dá)80-82
• 4.3.6 RNase J1和J2的晶體篩選82-83
• 4.3.7 RNase J1和J2晶體優(yōu)化、數(shù)據(jù)收集和處理83-85
• 4.3.8 RNase J1與PNPase,CshA蛋白相互作用的檢測(cè)85
• 4.3.9 RNase J1和J2在溶液中的聚集狀態(tài)85
• 4.3.10 本章小結(jié)85-87
• 參考文獻(xiàn)87-91
• 致謝91-93
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的其他研究成果93

【共引文獻(xiàn)】

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7 吳e

本文編號(hào)：309494