本文關鍵詞：構建人呼吸道合胞病毒反基因組cDNA及其拯救嘗試，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：通過RNA反向遺傳學操作,克隆人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)反基因組cDNA,并構建以T7RNA多聚酶(T7RNA polymerase, T7RNP)為啟動子、插入有綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecent protein, EGFP)的RSV反基因組cDNA重組質粒pBRAT-RSV-EGFP,通過MVA-T7痘苗病毒等提供T7RNP,探討拯救可表達EGFP的重組人呼吸道合胞病毒(rRSV/EGFP)的條件。 方法：利用分子病毒學和分子生物學技術,以經(jīng)過改造的pBR322質粒為克隆載體,通過多步克隆操作,獲得編碼RSV反基因組的cDNA克隆,并且將EGFP表達盒插入到RSV反基因組cDNA扣,構建重組RSV反基因組質粒pBRAT-RSV-EGFP�？寺〉姆椿蚪McDNA位于T7啟動子下游和丁肝核酶(HDV ribozyme,δ)以及T7轉錄終止信號的上游,經(jīng)核酸內切酶及核酸序列分析后,分別用MVA-T7病毒、BSR T7/5細胞和pcDNA3.1-T7RNP質粒提供T7RNP,同時轉染pBRAT-RSV-EGFP,經(jīng)轉錄獲得重組RSV單股正鏈的反基因組,以可表達四種RSV核衣殼蛋白或多聚酶蛋白的質粒pcDNA3.1-N-OPT、pcDNA3.1-P-OPT、pcDNA3.1-M2-1-OPT和pcDNA3.1-L-OPT為輔助質粒,并共轉染至BSR T7/5細胞或瞬時表達T7RNP的HEp-2拯救rRSV/EGFP,觀察綠色熒光表達情況評估拯救的條件。 結果：經(jīng)核酸內切酶及核酸序列分析證實,RSV反基因組cDNA及插入有EGFP的RSV反基因組cDNA克隆及其重組質粒均成功獲得。與BSR T7/5細胞和pcDNA3.1-T7RNP質粒相比,以MVA-T7感染HEp-2細胞,能夠高效提供T7RNP,是用于重組RSV拯救的有效方法。 結論：成功克隆及構建了可表達EGFP的RSV反基因組cDNA及其重組質粒,并對拯救體系進行了比較研究,這些工作為最終實現(xiàn)重組RSV的成功拯救提供了有益的經(jīng)驗。
【關鍵詞】：呼吸道合胞病毒 綠色熒光蛋白 反向遺傳學 拯救 反基因組 cDNA克隆
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R373.1
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 1 引言10-12
• 2 實驗材料12-16
• 2.1 細胞、載體、感受態(tài)細胞和病毒12
• 2.2 工具酶與試劑盒12
• 2.3 主要生化試劑12-13
• 2.4 主要實驗儀器13-14
• 2.5 主要溶液配制14-16
• 3 實驗方法16-42
• 3.1 細胞培養(yǎng)16-17
• 3.2 感受態(tài)細胞的制備17-18
• 3.3 EGFP基因的獲得與鑒定18-22
• 3.3.1 EGFP基因的PCR擴增18-19
• 3.3.2 PCR產物的膠回收19-20
• 3.3.3 PCR產物加A尾及純化20
• 3.3.4 T載體連接及轉化20-21
• 3.3.5 質粒的提取及鑒定21-22
• 3.4 RSV反基因組cDNA的分段克隆22-29
• 3.5 SH基因的改造29-31
• 3.6 PBRAT質粒的構建及鑒定31-33
• 3.6.1 DNA連接子的獲得31
• 3.6.2 酶切pBR322載體并回收31-32
• 3.6.3 pBRAT質粒的連接及鑒定32-33
• 3.7 攜帶EGFP基因的RSV反基因組質粒的構建及鑒定33-39
• 3.7.1 攜帶EGFP基因的RSV反基因組質粒的構建33-37
• 3.7.2 攜帶EGFP基因的RSV反基因組質粒的鑒定37-39
• 3.8 MVA-T7病毒培養(yǎng)與鑒定39
• 3.8.1 MVA-T7病毒的培養(yǎng)39
• 3.8.2 免疫酶法測定MVA-T7病毒的滴度39
• 3.9 重組RSV病毒的拯救39-42
• 3.9.1 MVA-T7拯救重組RSV病毒40
• 3.9.2 用質粒提供T7 RNP拯救重組RSV病毒40-41
• 3.9.3 用BSR T7/5細胞拯救重組RSV病毒41-42
• 4 實驗結果42-51
• 4.1 質粒和病毒的鑒定42-46
• 4.1.1 RSV反基因組cDNA各片段克隆質粒及pBRAT載體的鑒定42-44
• 4.1.2 SH基因改造的鑒定44
• 4.1.3 攜帶EGFP基因的重組RSV反基因組質粒的鑒定44-45
• 4.1.4 MVA-T7病毒的鑒定45-46
• 4.2 MVA-T7拯救重組RSV病毒46-47
• 4.3 用質粒提供T7 RNP拯救重組RSV病毒47
• 4.4 用BSR T7/5細胞拯救重組RSV病毒47-48
• 4.5 重組RSV基因組核酸序列分析48-51
• 5 討論51-53
• 6 結論53-54
• 參考文獻54-56
• 附錄A 英文縮略詞表56-57
• 碩士期間發(fā)表論文情況57-58
• 作者簡歷58-60
• 學位論文數(shù)據(jù)集60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 何金生;付遠輝;洪濤;;人呼吸道合胞病毒活疫苗研究進展[J];中國科學:生命科學;2011年01期

  本文關鍵詞：構建人呼吸道合胞病毒反基因組cDNA及其拯救嘗試，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：309739