發(fā)布時間：2017-04-15 22:30

  本文關(guān)鍵詞：DNA四面體探針電化學(xué)生物傳感器檢測甲型H7N9流感病毒的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：2013年初，甲型H7N9流感病毒首例呼吸道感染者在我國被發(fā)現(xiàn)以來，至今在國內(nèi)外仍有零星病發(fā)，曾一度引起嚴重的社會恐慌，對經(jīng)濟、社會的發(fā)展造成了一定程度的影響。同時，，通過基因突變或重組，甲型H7N9流感病毒具備高感染性并在適合條件下進行大規(guī)模流行的可能性仍難以避免。而流感病毒傳統(tǒng)的檢測方法都需要較為復(fù)雜的樣品前處理過程，費時費力，價格昂貴。因此開發(fā)優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法的甲型H7N9流感病毒現(xiàn)場快速檢測技術(shù)，對甲型H7N9流感病毒的預(yù)防和控制都具有非常重要的意義。 DNA電化學(xué)生物傳感器可以特異性識別病原微生物的核酸序列，從基因水平上實現(xiàn)對病原體的檢測和診斷，具備快速、靈敏、成本低、易于自動化和便攜化等優(yōu)點，還有對目標物實現(xiàn)實時多重檢測的潛能，使其在病原體檢測方面成為最具有應(yīng)用前景的一類生物傳感器。 DNA四面體結(jié)構(gòu)是通過巧妙的DNA序列設(shè)計，應(yīng)用互補配對的原則，各鏈自動雜交結(jié)合而成的具有四面體形狀的DNA三維納米結(jié)構(gòu)分子。DNA四面體探針（TEP, DNATetrahedral Probe）是在四面體的三個頂點上修飾巰基并通過Au-S鍵固定在電極表面，在另外一個頂點處延伸出一段特異性ssDNA作為探針實現(xiàn)對目標序列的識別結(jié)合。作為探針，基于DNA納米技術(shù)自組裝的DNA四面體結(jié)構(gòu)納米材料的表面效應(yīng)、方位效應(yīng)和內(nèi)部的孔隙效應(yīng)能促其進對目標序列的有效識別與結(jié)合，顯著提高電子擴散和傳遞效率，在DNA電化學(xué)生物傳感器檢測方面具有很大的應(yīng)用潛能�；贒NA四面體探針的電化學(xué)生物傳感器，已經(jīng)開展了部分人工合成核酸序列和其他生物分子檢測的基礎(chǔ)研究，但是目前仍然沒有關(guān)于使用TEP DNA電化學(xué)傳感器檢測傳染病實際樣本的報道。其中，如何快速地獲取核酸檢測目標序列、減少對PCR的依賴、降低背景干擾等，從而實現(xiàn)對傳染病病原簡單、靈敏、準確、快速的檢測仍然有待研究解決。 以對甲型H7N9流感病毒的檢測防控為目的，本文構(gòu)建了一種基于TEP的DNA電化學(xué)生物傳感器（TEP傳感器）用于甲型H7N9流感病毒核酸樣本的檢測，在基因水平上實現(xiàn)對甲型H7N9流感病毒簡便、快速、靈敏、特異的檢測，主要研究方法和成果如下： 1.根據(jù)WHO公開的編碼甲型H7N9流感病毒血凝素蛋白（HA）的特異性保守核酸序列片段，設(shè)計出了用于TEP合成的四條ssDNA序列。PAGE凝膠電泳定性分析和TotalLab程序定量分析結(jié)果顯示，使用簡單的一步熱變性便可成功合成DNA四面體結(jié)構(gòu)探針，合成效率高達96%。 2.將合成的TEP通過Au-S鍵的方式固定在工作金電極表面，以目標序列為媒介，固定在金電極表面的四面體探針與引入的生物素修飾的ssDNA檢測探針（Bio-ssDNA）形成夾心模式。然后再通過鏈霉親合素與生物素特異性結(jié)合引入鏈霉親合素標記的辣根過氧化物酶（Avidin-HRP）信號放大劑。最后使用安培法通過監(jiān)測辣根過氧化物酶催化底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）發(fā)生氧化還原反應(yīng)的強弱實現(xiàn)對目標序列的檢測。使用循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)交流阻抗法（EIS）對TEP傳感器的制作過程進行了表征。 3.該TEP傳感器對合成目標序列在兩個不同濃度范圍內(nèi)的檢測響應(yīng)信號和濃度的對數(shù)分別呈兩個不同的線性關(guān)系，并通過建立類米氏方程模型對該現(xiàn)象進行了分析。該TEP傳感器對合成目標序列檢測靈敏度約為0.4pM，體現(xiàn)了高靈敏度的特點。能夠明顯從非完全互補序列中特異性識別區(qū)分出目標序列，對堿基突變序列表現(xiàn)出良好的檢測特異性。 4.該TEP傳感器對咽拭子過濾性甲型H7N9流感病毒RNA提取物的不對稱PCR ssDNA目標序列靈敏度的響應(yīng)信號與ssDNA產(chǎn)物濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，檢測下限為0.1pM，并且該TEP傳感器還能夠從甲型H1N1和H3N2等其他流感病毒核酸中明顯識別區(qū)分出甲型H7N9流感病毒，在基因水平上實現(xiàn)了對甲型H7N9流感病毒樣本靈敏、特異的檢測。 5以甲型H7N9流感病毒cDNA為模板，該TEP傳感器能夠檢測識別出低至一個循環(huán)數(shù)的不對稱PCR ssDNA目標序列。同時，在低循環(huán)數(shù)下，對甲型H7N9流感病毒cDNA不對稱PCR產(chǎn)物具有良好的特異性。
【關(guān)鍵詞】：電化學(xué)生物傳感器 DNA 四面體結(jié)構(gòu)探針 甲型H7N9流感病毒 病原體檢測
【學(xué)位授予單位】：太原理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q81;R373
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 符號說明與縮略語13-15
• 第一章 緒論15-35
• 1.1 病原微生物的快速檢測15-16
• 1.2 生物傳感器概述16-19
• 1.2.1 生物傳感器的發(fā)展歷史16-17
• 1.2.2 生物傳感器的工作原理17-18
• 1.2.3 電化學(xué)生物傳感器18-19
• 1.3 DNA 電化學(xué)生物傳感器19-25
• 1.3.1 工作原理19
• 1.3.2 DNA電化學(xué)生物傳感器的探針設(shè)計19-21
• 1.3.3 DNA探針的修飾固定方法21-22
• 1.3.4 DNA電化學(xué)生物傳感器信號轉(zhuǎn)換機制22
• 1.3.5 納米材料用于DNA電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建22-25
• 1.4 DNA四面體結(jié)構(gòu)納米材料25-31
• 1.4.1 自組裝原理26-27
• 1.4.2 DNA四面體結(jié)構(gòu)的功能化和智能化27-29
• 1.4.3 在體內(nèi)診斷與藥物治療方面的應(yīng)用研究29-30
• 1.4.4 在生物傳感器體外檢測方面的應(yīng)用30-31
• 1.5 本研究的目的及意義31-35
• 1.5.1 研究目的及意義31-32
• 1.5.2 本文的主要工作32-35
• 第二章 DNA四面體探針的設(shè)計及自組裝合成35-43
• 2.1 引言35-36
• 2.2 實驗材料和儀器36-37
• 2.2.1 實驗試劑及材料36
• 2.2.2 實驗儀器36-37
• 2.3 實驗方法37-38
• 2.3.1 DNA四面體結(jié)構(gòu)探針的合成37
• 2.3.2 DNA四面體結(jié)構(gòu)探針的PAGE表征37-38
• 2.4 實驗結(jié)果與討論38-42
• 2.4.1 DNA四面體結(jié)構(gòu)探針合成效果的定性分析38-40
• 2.4.2 DNA四面體結(jié)構(gòu)探針合成效果的定量分析40-42
• 2.5 本章小結(jié)42-43
• 第三章 核酸四面體探針DNA電化學(xué)生物傳感器的制備及表征43-67
• 3.1 引言43-48
• 3.1.1 循環(huán)伏安法43-45
• 3.1.2 交流阻抗法45-47
• 3.1.3 安培法47-48
• 3.2 實驗材料和儀器48-49
• 3.2.1 實驗試劑48-49
• 3.2.2 實驗儀器49
• 3.3 實驗方法49-52
• 3.3.1 工作電極的預(yù)處理49-50
• 3.3.2 TEP的修飾及生物傳感器制作過程的表征50-51
• 3.3.3 與單鏈DNA探針傳感器檢測性能的對比51
• 3.3.4 對合成目標序列檢測性能的評價51-52
• 3.4 結(jié)果與討論52-64
• 3.4.1 工作電極的預(yù)處理效果52-53
• 3.4.2 TEP的修飾及傳感器制作過程的CV表征結(jié)果53-57
• 3.4.3 TEP的修飾及傳感器制作過程的EIS表征結(jié)果57-60
• 3.4.4 與單鏈探針傳感器對目標序列檢測信號響應(yīng)的對比60-61
• 3.4.5 對合成目標序列的檢測靈敏度61-63
• 3.4.6 對合成目標序列的特異性響應(yīng)63-64
• 3.5 本章小結(jié)64-67
• 第四章 在甲型H7N9 流感病毒核酸檢測中的應(yīng)用67-85
• 4.1 引言67-68
• 4.2 實驗材料和儀器68-69
• 4.2.1 實驗材料及試劑68-69
• 4.2.2 實驗儀器69
• 4.3 實驗方法69-75
• 4.3.1 流感病毒的分離培養(yǎng)鑒定69-70
• 4.3.2 RNA的提取與PCR擴增70-73
• 4.3.3 單鏈DNA目標序列的不對稱PCR法制備73-74
• 4.3.4 TEP生物傳感器對雙鏈和單鏈目標物的檢測74
• 4.3.5 檢測靈敏度的測定74
• 4.3.6 檢測特異性的測定74-75
• 4.3.7 對低循環(huán)數(shù)不對稱PCR產(chǎn)物的檢測75
• 4.4 結(jié)果與討論75-82
• 4.4.1 流感病毒細胞培養(yǎng)液的血凝滴度75
• 4.4.2 PCR擴增產(chǎn)物的驗證結(jié)果75-76
• 4.4.3 不對稱PCR 目標產(chǎn)物的鑒定76-78
• 4.4.4 TEP生物傳感器對雙鏈和單鏈目標物的檢測性能78-79
• 4.4.5 對不對稱PCR產(chǎn)物的檢測的靈敏度79-80
• 4.4.6 對不對稱PCR 產(chǎn)物的特異性響應(yīng)80-81
• 4.4.7 對低循環(huán)數(shù)不對稱PCR產(chǎn)物的檢測響應(yīng)結(jié)果81-82
• 4.5 本章小結(jié)82-85
• 第五章 總結(jié)與展望85-87
• 5.1 總結(jié)85-86
• 5.2 展望86-87
• 參考文獻87-99
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文/專利申請目錄99-100
• 致謝100-101

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 蔡苗;王強斌;;結(jié)構(gòu)DNA納米技術(shù)[J];化學(xué)進展;2010年05期

2 錢璐璐;汪穎;張釗;趙健;潘敦;張益;劉強;樊春海;胡鈞;賀林;;DNA納米結(jié)構(gòu)仿中國地圖[J];科學(xué)通報;2006年24期

3 聞艷麗;林美華;裴昊;魯娜;樊春海;;基于電化學(xué)技術(shù)的microRNA生物傳感器[J];化學(xué)進展;2012年09期

4 賈思思;晁潔;樊春海;柳華杰;;DNA折紙術(shù)納米反應(yīng)器[J];化學(xué)進展;2014年05期

5 ;Electrochemical single nucleotide polymorphisms genotyping on surface immobilized three-dimensional branched DNA nanostructure[J];Science China(Chemistry);2011年08期

6 刁天喜;徐守軍;趙曉宇;周巍;李鵬;劉術(shù);王偉;;埃博拉出血熱藥物和疫苗研究開發(fā)態(tài)勢分析[J];軍事醫(yī)學(xué);2014年08期

  本文關(guān)鍵詞：DNA四面體探針電化學(xué)生物傳感器檢測甲型H7N9流感病毒的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：309414