發(fā)布時(shí)間：2017-04-14 00:12

  本文關(guān)鍵詞：HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)屬于黃病毒科肝炎病毒屬。盡管機(jī)體免疫系統(tǒng)通過(guò)多種途徑識(shí)別并清除HCV及病毒蛋白,但仍有部分患者在急性感染期不能有效清除病毒,發(fā)展為慢性感染,提示HCV可通過(guò)多種機(jī)制來(lái)逃逸宿主的免疫攻擊。HCV核心蛋白不僅構(gòu)成病毒核衣殼、參與病毒復(fù)制和組裝,還與免疫細(xì)胞表面或者胞內(nèi)蛋白相互作用,誘導(dǎo)馴化免疫細(xì)胞,為其提供合適的生存環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn),HCV核心蛋白與補(bǔ)體受體(globular heads of C1q receptor,g C1q R)結(jié)合,不僅抑制IL-12產(chǎn)生,還干擾T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)活化信號(hào)通路,抑制抗病毒免疫應(yīng)答;或者通過(guò)與JAK/STAT信號(hào)通路的多種成分相互作用,影響IFN-α的產(chǎn)生,從而抑制抗病毒基因干擾素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的活化。單核/巨噬細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮抗感染的第一道防線,其中單核細(xì)胞約占外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的1-6%,趨化至肝內(nèi)感染部位,分化為巨噬細(xì)胞和枯否氏細(xì)胞。大量研究結(jié)果表明,單核/巨噬細(xì)胞在HCV感染后的疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在HCV感染機(jī)體早期,單核/巨噬細(xì)胞可輔助HCV病毒的復(fù)制和持續(xù)感染的建立。Gyongyi Szabo等對(duì)慢性HCV感染患者的肝組織進(jìn)行病理學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)大量活化的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。本室前期研究發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白、肝細(xì)胞共同作用可使巨噬細(xì)胞表達(dá)M2型分子CD206升高。同時(shí)后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明了HCV核心蛋白通過(guò)與巨噬細(xì)胞表面補(bǔ)體受體g C1q R結(jié)合,誘導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子A20高表達(dá)及炎癥因子的低度分泌。因此,本研究擬通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)通路間相互作用觀察HCV核心蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ的影響,并初步探討其機(jī)制,為進(jìn)一步系統(tǒng)闡述HCV核心蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1人單核細(xì)胞THP-1經(jīng)PMA(15ng/ml)誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞,命名為m THP-1細(xì)胞。以不同濃度HCV核心蛋白(1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)分別作用不同來(lái)源巨噬細(xì)胞m THP-1和RAW264.70.5h,Western blot檢測(cè)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB Phospho-P65和PhosphoERK變化情況。同時(shí)以PBS組做為陰性對(duì)照組,LPS(1μg/ml)組作為陽(yáng)性對(duì)照組。并確定HCV核心蛋白作用的最適濃度為5μg/ml。2 HCV核心蛋白(5μg/ml)和LPS以不同分組方式分別作用m THP-1、RAW264.7和BMDM細(xì)胞6h,收集細(xì)胞;采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γm RNA的表達(dá)變化,流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)IFN-γ蛋白的變化。同時(shí)設(shè)PBS作用組和LPS作用組分別做為陰性和陽(yáng)性對(duì)照組,HCV核心蛋白作用組及HCV核心蛋白+LPS共同作用組為實(shí)驗(yàn)組。3應(yīng)用NF-κB通路阻斷劑JSH-23(10μM)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h后,加入LPS(1μg/ml)再次作用細(xì)胞6h,收集細(xì)胞,采用qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測(cè)IFN-γm RNA和蛋白的表達(dá)變化。4 HCV核心蛋白(5μg/ml)和LPS(1μg/ml)以不同分組方式分別作用m THP-1、RAW264.7和BMDM細(xì)胞0.5h后,Western blot檢測(cè)不同細(xì)胞的信號(hào)通路分子p-P65、p-P105、p-ERK、p-JNK和p-P38的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組同2。5不同濃度的HCV核心蛋白(1μg/ml、3μg/ml和5μg/ml)和LPS(1μg/ml)共同作用RAW264.7細(xì)胞0.5h后,Western blot檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路分子p-P65、p-P105和p-ERK的變化情況。設(shè)PBS組和LPS組為對(duì)照組。6以ERK通路阻斷劑PD98059(10μM、25μM和50μM)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h后,加入LPS(1μg/ml)作用0.5h后,Western blot檢測(cè)p-ERK表達(dá)變化,確定抑制劑使用的最佳濃度為50μM。7應(yīng)用ERK阻斷劑PD98059預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h后,加入LPS(1μg/ml)和HCV(5μg/ml)核心蛋白繼續(xù)作用0.5h或者6h后分別收集細(xì)胞,采用Western blot和qRT-PCR檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)通路分子NF-κB p-P65、p-P105和IFN-γm RNA的表達(dá)變化。同時(shí)設(shè)PBS組和LPS組為對(duì)照組。8分別應(yīng)用JNK阻斷劑SP600125和P38阻斷劑SB203580預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h后,加入LPS(1μg/ml)和HCV核心蛋白(5μg/m l)繼續(xù)作用6h后分別收集細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測(cè)IFN-γm RNA的表達(dá)變化。同時(shí)設(shè)PBS組和LPS組為對(duì)照組。結(jié)果:1 HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γqRT-PCR檢測(cè)m THP-1、RAW264.7及BMDM三種細(xì)胞表達(dá)IFN-γm RNA的水平,與LPS組相比,HCV核心蛋白+LPS共同作用組細(xì)胞表達(dá)IFN-γm RNA水平均顯著降低(P0.05)。同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞在不同刺激劑作用下IFN-γ蛋白的表達(dá)變化,與qRT-PCR結(jié)果一致。2 LPS通過(guò)活化NF-κB通路誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ應(yīng)用NF-κB通路阻斷劑JSH-23預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞后,與未加阻斷劑的陽(yáng)性對(duì)照組相比,LPS作用巨噬細(xì)胞IFN-γm RNA表達(dá)顯著降低(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)染色法檢測(cè)的結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果一致,與未加阻斷劑的陽(yáng)性對(duì)照組相比,JSH-23預(yù)處理細(xì)胞后LPS組IFN-γ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。3 HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞P65和P105的磷酸化Western blot結(jié)果顯示,LPS和HCV核心蛋白作用m THP-1、RAW264.7及BMDM細(xì)胞后,與PBS組比較,LPS組NF-κB p-P65和p-P105升高;與LPS組相比,在HCV核心蛋白+LPS組中,NF-κB pP65和p-P105表達(dá)降低。應(yīng)用不同濃度HCV核心蛋白與LPS共同作用RAW264.7細(xì)胞,Western blot結(jié)果顯示,隨著HCV核心蛋白濃度升高,細(xì)胞內(nèi)的NF-κB p-P65和p-P105的表達(dá)水平減少,提示HCV核心蛋白抑制被LPS誘導(dǎo)的NF-κB p-P65和p-P105的表達(dá)具有濃度依賴(lài)性。4 HCV核心蛋白和LPS均可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞P65和ERK的磷酸化以不同濃度HCV核心蛋白刺激m THP-1和RAW264.7細(xì)胞,使用Western blot方法檢測(cè)胞內(nèi)p-P65和p-ERK表達(dá)變化,與PBS組比較,LPS組細(xì)胞p-P65和p-ERK明顯升高;雖然HCV核心蛋白也可引起pP65和p-ERK升高,但是活化程度弱于單獨(dú)LPS刺激組。5 HCV核心蛋白不能抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞ERK的磷酸化Western blot結(jié)果顯示,與LPS組比較,LPS+HCV核心蛋白共同作用組細(xì)胞p-ERK的表達(dá)水平無(wú)明顯降低。應(yīng)用不同濃度HCV核心蛋白與LPS共同作用RAW264.7細(xì)胞,Western blot結(jié)果顯示,隨著HCV核心蛋白濃度升高,細(xì)胞的p-ERK的表達(dá)水平無(wú)明顯降低。6 HCV核心蛋白通過(guò)活化ERK通路抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NF-κB通路的活化和IFN-γm RNA表達(dá)的升高應(yīng)用PD98059阻斷ERK通路后,與LPS組比較,HCV核心蛋白+LPS共同作用組胞內(nèi)NF-κB p-P65和p-P105表達(dá)無(wú)明顯差異,并且兩組間IFN-γm RNA的表達(dá)也無(wú)明顯差異。7 HCV核心蛋白不能通過(guò)JNK或P38通路抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IFN-γm RNA表達(dá)的升高Western blot結(jié)果顯示,與LPS組比較,LPS+HCV核心蛋白共同作用組細(xì)胞p-JNK和p-P38的表達(dá)水平無(wú)明顯降低。分別應(yīng)用JNK阻斷劑SP600125和P38阻斷劑SB203580阻斷JNK和P38通路后,與LPS組比較,HCV核心蛋白+LPS共同作用組胞內(nèi)IFN-γm RNA的表達(dá)仍顯著降低(P0.05)。結(jié)論:1 HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。2 HCV核心蛋白可通過(guò)活化ERK通路抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒核心蛋白 巨噬細(xì)胞 干擾素 核轉(zhuǎn)錄因子κB ERK
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R373.21
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫(xiě)13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-28
• 結(jié)果28-30
• 附圖30-39
• 討論39-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 綜述 在HCV感染過(guò)程中固有免疫細(xì)胞間的相互作用47-72
• 參考文獻(xiàn)57-72
• 致謝72-73
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷73

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Hui-Chun Li;Hsin-Chieh Ma;Chee-Hing Yang;Shih-Yen Lo;;Production and pathogenicity of hepatitis C virus core gene products[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

  本文關(guān)鍵詞：HCV核心蛋白抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：304782