本文關鍵詞：HCV核心蛋白抑制LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)屬于黃病毒科肝炎病毒屬。盡管機體免疫系統(tǒng)通過多種途徑識別并清除HCV及病毒蛋白,但仍有部分患者在急性感染期不能有效清除病毒,發(fā)展為慢性感染,提示HCV可通過多種機制來逃逸宿主的免疫攻擊。HCV核心蛋白不僅構成病毒核衣殼、參與病毒復制和組裝,還與免疫細胞表面或者胞內(nèi)蛋白相互作用,誘導馴化免疫細胞,為其提供合適的生存環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn),HCV核心蛋白與補體受體(globular heads of C1q receptor,g C1q R)結合,不僅抑制IL-12產(chǎn)生,還干擾T細胞受體(T cell receptor,TCR)活化信號通路,抑制抗病毒免疫應答;或者通過與JAK/STAT信號通路的多種成分相互作用,影響IFN-α的產(chǎn)生,從而抑制抗病毒基因干擾素刺激基因(interferon stimulated genes,ISGs)的活化。單核/巨噬細胞是機體發(fā)揮抗感染的第一道防線,其中單核細胞約占外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的1-6%,趨化至肝內(nèi)感染部位,分化為巨噬細胞和枯否氏細胞。大量研究結果表明,單核/巨噬細胞在HCV感染后的疾病進程中發(fā)揮重要作用。在HCV感染機體早期,單核/巨噬細胞可輔助HCV病毒的復制和持續(xù)感染的建立。Gyongyi Szabo等對慢性HCV感染患者的肝組織進行病理學分析,發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)大量活化的巨噬細胞浸潤。本室前期研究發(fā)現(xiàn)HCV核心蛋白、肝細胞共同作用可使巨噬細胞表達M2型分子CD206升高。同時后續(xù)實驗證明了HCV核心蛋白通過與巨噬細胞表面補體受體g C1q R結合,誘導負調(diào)控因子A20高表達及炎癥因子的低度分泌。因此,本研究擬通過檢測胞內(nèi)信號通路間相互作用觀察HCV核心蛋白對LPS誘導巨噬細胞分泌IFN-γ的影響,并初步探討其機制,為進一步系統(tǒng)闡述HCV核心蛋白對巨噬細胞活性的影響提供實驗依據(jù)。方法:1人單核細胞THP-1經(jīng)PMA(15ng/ml)誘導分化為巨噬細胞,命名為m THP-1細胞。以不同濃度HCV核心蛋白(1μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)分別作用不同來源巨噬細胞m THP-1和RAW264.70.5h,Western blot檢測胞內(nèi)轉錄因子NF-κB Phospho-P65和PhosphoERK變化情況。同時以PBS組做為陰性對照組,LPS(1μg/ml)組作為陽性對照組。并確定HCV核心蛋白作用的最適濃度為5μg/ml。2 HCV核心蛋白(5μg/ml)和LPS以不同分組方式分別作用m THP-1、RAW264.7和BMDM細胞6h,收集細胞;采用qRT-PCR檢測細胞因子IFN-γm RNA的表達變化,流式細胞術胞內(nèi)染色法檢測RAW264.7細胞表達IFN-γ蛋白的變化。同時設PBS作用組和LPS作用組分別做為陰性和陽性對照組,HCV核心蛋白作用組及HCV核心蛋白+LPS共同作用組為實驗組。3應用NF-κB通路阻斷劑JSH-23(10μM)預處理RAW264.7細胞1h后,加入LPS(1μg/ml)再次作用細胞6h,收集細胞,采用qRT-PCR和流式細胞術胞內(nèi)染色法檢測IFN-γm RNA和蛋白的表達變化。4 HCV核心蛋白(5μg/ml)和LPS(1μg/ml)以不同分組方式分別作用m THP-1、RAW264.7和BMDM細胞0.5h后,Western blot檢測不同細胞的信號通路分子p-P65、p-P105、p-ERK、p-JNK和p-P38的表達變化。實驗組及對照組同2。5不同濃度的HCV核心蛋白(1μg/ml、3μg/ml和5μg/ml)和LPS(1μg/ml)共同作用RAW264.7細胞0.5h后,Western blot檢測細胞信號通路分子p-P65、p-P105和p-ERK的變化情況。設PBS組和LPS組為對照組。6以ERK通路阻斷劑PD98059(10μM、25μM和50μM)預處理RAW264.7細胞1h后,加入LPS(1μg/ml)作用0.5h后,Western blot檢測p-ERK表達變化,確定抑制劑使用的最佳濃度為50μM。7應用ERK阻斷劑PD98059預處理RAW264.7細胞1h后,加入LPS(1μg/ml)和HCV(5μg/ml)核心蛋白繼續(xù)作用0.5h或者6h后分別收集細胞,采用Western blot和qRT-PCR檢測胞內(nèi)信號通路分子NF-κB p-P65、p-P105和IFN-γm RNA的表達變化。同時設PBS組和LPS組為對照組。8分別應用JNK阻斷劑SP600125和P38阻斷劑SB203580預處理RAW264.7細胞1h后,加入LPS(1μg/ml)和HCV核心蛋白(5μg/m l)繼續(xù)作用6h后分別收集細胞,采用qRT-PCR檢測IFN-γm RNA的表達變化。同時設PBS組和LPS組為對照組。結果:1 HCV核心蛋白抑制LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γqRT-PCR檢測m THP-1、RAW264.7及BMDM三種細胞表達IFN-γm RNA的水平,與LPS組相比,HCV核心蛋白+LPS共同作用組細胞表達IFN-γm RNA水平均顯著降低(P0.05)。同時采用流式細胞術胞內(nèi)染色法檢測RAW264.7細胞在不同刺激劑作用下IFN-γ蛋白的表達變化,與qRT-PCR結果一致。2 LPS通過活化NF-κB通路誘導巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ應用NF-κB通路阻斷劑JSH-23預處理RAW264.7細胞后,與未加阻斷劑的陽性對照組相比,LPS作用巨噬細胞IFN-γm RNA表達顯著降低(P0.05)。流式細胞術胞內(nèi)染色法檢測的結果與熒光定量PCR結果一致,與未加阻斷劑的陽性對照組相比,JSH-23預處理細胞后LPS組IFN-γ陽性細胞數(shù)明顯減少。3 HCV核心蛋白抑制LPS誘導巨噬細胞P65和P105的磷酸化Western blot結果顯示,LPS和HCV核心蛋白作用m THP-1、RAW264.7及BMDM細胞后,與PBS組比較,LPS組NF-κB p-P65和p-P105升高;與LPS組相比,在HCV核心蛋白+LPS組中,NF-κB pP65和p-P105表達降低。應用不同濃度HCV核心蛋白與LPS共同作用RAW264.7細胞,Western blot結果顯示,隨著HCV核心蛋白濃度升高,細胞內(nèi)的NF-κB p-P65和p-P105的表達水平減少,提示HCV核心蛋白抑制被LPS誘導的NF-κB p-P65和p-P105的表達具有濃度依賴性。4 HCV核心蛋白和LPS均可誘導巨噬細胞P65和ERK的磷酸化以不同濃度HCV核心蛋白刺激m THP-1和RAW264.7細胞,使用Western blot方法檢測胞內(nèi)p-P65和p-ERK表達變化,與PBS組比較,LPS組細胞p-P65和p-ERK明顯升高;雖然HCV核心蛋白也可引起pP65和p-ERK升高,但是活化程度弱于單獨LPS刺激組。5 HCV核心蛋白不能抑制LPS誘導巨噬細胞ERK的磷酸化Western blot結果顯示,與LPS組比較,LPS+HCV核心蛋白共同作用組細胞p-ERK的表達水平無明顯降低。應用不同濃度HCV核心蛋白與LPS共同作用RAW264.7細胞,Western blot結果顯示,隨著HCV核心蛋白濃度升高,細胞的p-ERK的表達水平無明顯降低。6 HCV核心蛋白通過活化ERK通路抑制LPS誘導巨噬細胞NF-κB通路的活化和IFN-γm RNA表達的升高應用PD98059阻斷ERK通路后,與LPS組比較,HCV核心蛋白+LPS共同作用組胞內(nèi)NF-κB p-P65和p-P105表達無明顯差異,并且兩組間IFN-γm RNA的表達也無明顯差異。7 HCV核心蛋白不能通過JNK或P38通路抑制LPS誘導巨噬細胞IFN-γm RNA表達的升高Western blot結果顯示,與LPS組比較,LPS+HCV核心蛋白共同作用組細胞p-JNK和p-P38的表達水平無明顯降低。分別應用JNK阻斷劑SP600125和P38阻斷劑SB203580阻斷JNK和P38通路后,與LPS組比較,HCV核心蛋白+LPS共同作用組胞內(nèi)IFN-γm RNA的表達仍顯著降低(P0.05)。結論:1 HCV核心蛋白抑制LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ。2 HCV核心蛋白可通過活化ERK通路抑制LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒核心蛋白 巨噬細胞 干擾素 核轉錄因子κB ERK
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-28
• 結果28-30
• 附圖30-39
• 討論39-41
• 結論41-42
• 參考文獻42-47
• 綜述 在HCV感染過程中固有免疫細胞間的相互作用47-72
• 參考文獻57-72
• 致謝72-73
• 個人簡歷73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Hui-Chun Li;Hsin-Chieh Ma;Chee-Hing Yang;Shih-Yen Lo;;Production and pathogenicity of hepatitis C virus core gene products[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 ;The Roles of Innate Immune Cells in Liver Injury and Regeneration[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年04期

  本文關鍵詞：HCV核心蛋白抑制LPS誘導巨噬細胞產(chǎn)生IFN-γ的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：304782