發(fā)布時(shí)間：2017-04-14 00:19

  本文關(guān)鍵詞：家蠅CCTζ基因的cDNA克隆、表達(dá)及表達(dá)模式研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:從家蠅的EST測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得家蠅的CCT(chaperonin containing t-complex polypeptide)基因MD-CCTζ,上傳Gen Bank分析分子特性后,進(jìn)行c DNA克隆、表達(dá);探討MD-CCTζ基因在家蠅不同組織和發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式;初步研究在不同病原微生物和熱脅迫條件下家蠅3齡幼蟲(chóng)的MD-CCTζ基因表達(dá)譜的變化。方法:1、MD-CCTζ的序列分析及c DNA克隆、表達(dá)。從課題組前期構(gòu)建的家蠅幼蟲(chóng)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到家蠅的CCTζ基因序列,通過(guò)序列分析,預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框,采用BLAST、EXPASY等生物信息學(xué)網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)MD-CCTζ基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域,二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等;從NCBI上下載其他物種CCTζ基因的氨基酸序列,借助MEGA 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);根據(jù)其c DNA序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增MD-CCTζ基因,將目的基因與表達(dá)載體PEASY-E1構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中,選擇合適溫度、時(shí)間使用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白,重組蛋白使用His·Tag融合蛋白試劑盒純化。2、家蠅CCTζ基因的時(shí)空表達(dá)分析。分別收集家蠅生活史各發(fā)育階段不同蟲(chóng)態(tài)(卵、1齡幼蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)、蛹),成蟲(chóng)不同性別(雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng))的蟲(chóng)體,提取總RNA后并逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR)技術(shù)檢測(cè)MD-CCTζ基因不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異;解剖家蠅3齡幼蟲(chóng),選擇幼蟲(chóng)的六種具有典型特征的組織器官(脂肪體、唾液腺、中腸、氣管、馬氏管和體壁)。提取相應(yīng)組織的總RNA并轉(zhuǎn)錄為c DNA。采用Real Time PCR檢測(cè)MD-CCTζ基因的空間表達(dá)差異。3、MD-CCTζ基因在家蠅3齡幼蟲(chóng)脅迫條件下的功能初探。分別將定量的不同病原微生物(白色念珠菌、大腸桿菌和及金黃色葡萄球菌)采用注射法導(dǎo)入到家蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi),采用Real Time PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)(3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h)CCTζ基因表達(dá)水平的變化。將3齡幼蟲(chóng)42℃熱脅迫,采用Real Time PCR檢測(cè)脅迫(0h、15min、30min、1h、1.5h、2h)后不同時(shí)間點(diǎn)MD-CCTζ基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1、生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,MD-CCTζ的ORF框全長(zhǎng)1596 bp,編碼一個(gè)含531個(gè)氨基酸的蛋白多肽,理論分子量為58260.47Da,等電點(diǎn)為6.56;無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,有2個(gè)CCT蛋白標(biāo)簽,具有CCT的功能結(jié)構(gòu)域,MD-CCTζ的三級(jí)結(jié)構(gòu)有多個(gè)α螺旋和β折疊,通過(guò)不規(guī)則卷曲相連,進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析與地中海實(shí)蠅CCT的遺傳距離較近。成功構(gòu)建了MD-CCTζ表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),重組蛋白獲得表達(dá),并得到純化蛋白。2、MD-CCTζ基因在家蠅體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)模式結(jié)果顯示,在家蠅卵、各齡幼蟲(chóng)、蛹和雌雄成蟲(chóng)各階段中,MD-CCTζ基因有不同程度的表達(dá)。MD-CCTζ基因在卵期表達(dá)量最高,其表達(dá)水平排列為卵雌蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)1齡幼蟲(chóng)蛹雄蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)。3、家蠅3齡幼蟲(chóng)的各主要組織中,MD-CCTζ基因在唾液腺和氣管中的表達(dá)水平明顯比體壁、脂肪體、中腸和馬氏管高,MD-CCTζ基因在各組織表達(dá)量為:唾液腺氣管馬氏管中腸脂肪體體壁。4、大腸桿菌誘導(dǎo)后MD-CCTζ在3h開(kāi)始輕微上調(diào),到6h、18h、36h出現(xiàn)下調(diào),在12h、24h、48h為上調(diào)狀態(tài),24h表達(dá)量最高。金黃色葡萄球菌、白色念珠菌誘導(dǎo)后在24h表達(dá)量最高,其它時(shí)間點(diǎn)MD-CCTζ基因表達(dá)趨于基礎(chǔ)免疫狀態(tài)。5、家蠅3齡幼蟲(chóng)在熱脅迫條件下的MD-CCTζ基因在15min后上調(diào),在2h顯著上調(diào)表達(dá)。結(jié)論:1、本研究成功對(duì)MD-CCTζ基因分子特性進(jìn)行了分析、克隆并表達(dá)了MD-CCTζ基因,得到了體外重組蛋白。2、初步揭示了MD-CCTζ基因在家蠅體內(nèi)的時(shí)空表達(dá)模式,提示MD-CCTζ基因在家蠅生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。3、MD-CCTζ基因在家蠅幼蟲(chóng)受到病原微生物及熱脅迫后表達(dá)量明顯上調(diào),提示MD-CCTζ基因參與了家蠅的抗脅迫過(guò)程,與家蠅幼蟲(chóng)抵抗外界不利環(huán)境有直接關(guān)系。
【關(guān)鍵詞】：家蠅 CCT 分子特性 克隆表達(dá) 表達(dá)模式
【學(xué)位授予單位】：貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R384.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 英文縮略詞表10-11
• 引言11-14
• 第一部分14-34
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-32
• 討論32-34
• 第二部分34-48
• 材料與方法34-38
• 結(jié)果38-46
• 討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述52-61
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 作者簡(jiǎn)歷61-62
• 致謝62-63
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集63

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 聶忠清;吳永剛;蒙建洲;;分子伴侶的功能和應(yīng)用[J];生命科學(xué);2006年01期

2 韓丁培;王蒲雄志;瞿順;陳雪華;宗雅萍;馮波;陸愛(ài)國(guó);鄭民華;;伴侶蛋白CCT6A參與結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的作用研究[J];外科理論與實(shí)踐;2011年04期

3 魏洪;吳建偉;王碩石;國(guó)果;付萍;;家蠅幼蟲(chóng)血淋巴提取物抗腫瘤作用[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2013年02期

  本文關(guān)鍵詞：家蠅CCTζ基因的cDNA克隆、表達(dá)及表達(dá)模式研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：304808