本文關(guān)鍵詞：抗c-Myc納米抗體的淘選、表達(dá)及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞中,存在著一類基因或者是基因家族,其在通常情況下為抑制狀態(tài)或維持較低表達(dá)水平,當(dāng)其在某些因素作用下,基因表達(dá)失去控制,細(xì)胞的正常生物學(xué)性狀會(huì)發(fā)生各種改變,逐步轉(zhuǎn)化成為惡性細(xì)胞,最終導(dǎo)致細(xì)胞甚至機(jī)體癌變。這類基因我們通常稱之為原癌基因(Proto-oncogene)。myc基因家族為原癌基因家族中的一類,主要分為c-myc、n-myc、l-myc三類基因。myc基因家族及其產(chǎn)物主要與調(diào)控細(xì)胞周期的DNA結(jié)合,控制細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。研究認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移同c-myc基因的激活有密切關(guān)系。量子點(diǎn)(QDs)是由II-VI族或III-V族元素組成的半導(dǎo)體材料,屬于納米晶體,受激后能發(fā)射熒光,可用于生物學(xué)分析。量子點(diǎn)激發(fā)光譜寬,同時(shí)發(fā)射光譜窄并且左右對(duì)稱,可以通過(guò)改變粒子大小控制熒光發(fā)射波長(zhǎng)。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比,量子點(diǎn)具有很高的量子產(chǎn)率和抗光漂白能力,而且熒光壽命長(zhǎng),具有良好的生物相容性。因此,量子點(diǎn)熒光技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域具有廣闊前景。本研究采用噬菌體展示技術(shù),從羊駝免疫庫(kù)中淘選能與c-Myc結(jié)合的納米抗體,并將淘選獲得的抗c-Myc納米抗體在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),純化的重組抗c-Myc納米抗體經(jīng)量子點(diǎn)標(biāo)記后,初步用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白的表達(dá)情況,主要研究結(jié)果如下:1、通過(guò)四輪固相淘選,從羊駝c-Myc蛋白免疫文庫(kù)中獲得了了11個(gè)能特異性結(jié)合c-Myc蛋白的克隆,分別為A13、A18、A25、A26、A31、A32、B34、C5、C24、C42、C46,并對(duì)這些克隆的親和力大小進(jìn)行了分析比較。2、選取親和力相對(duì)較高的克隆(A25和A26),分別將編碼基因克隆至表達(dá)載體pET-25b(+),在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中,使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,重組蛋白分子量約20 kDa,與預(yù)期分子大小相符。3、初步驗(yàn)證了利用量子點(diǎn)標(biāo)記重組納米抗體用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)檢測(cè)的方法。制備SP2/0細(xì)胞爬片,用量子點(diǎn)熒光標(biāo)記納米抗體,檢測(cè)c-Myc蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),加入納米抗體及量子點(diǎn)后,細(xì)胞顯示熒光,單純加入量子點(diǎn),無(wú)熒光反應(yīng),本研究得到的納米抗體有望實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)c-Myc蛋白表達(dá)情況檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：納米抗體 c-Myc ELISA 量子點(diǎn)
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 縮略語(yǔ)6-12
• 第1章 前言12-23
• 1.1 原癌基因myc概況12-17
• 1.1.1 原癌基因12
• 1.1.2 原癌基因分類12-13
• 1.1.3 myc基因的結(jié)構(gòu)與功能13-15
• 1.1.4 c-Myc蛋白的作用機(jī)制15-17
• 1.1.5 c-myc與腫瘤17
• 1.2 c-myc在檢測(cè)中的研究進(jìn)展17-19
• 1.2.1 基于c-myc基因的檢測(cè)方法17-18
• 1.2.2 基于c-Myc蛋白的檢測(cè)方法18
• 1.2.3 c-Myc作為蛋白融合標(biāo)簽的應(yīng)用18-19
• 1.3 量子點(diǎn)概述19-22
• 1.3.1 量子點(diǎn)定義19
• 1.3.2 量子點(diǎn)光學(xué)特征19-20
• 1.3.3 量子點(diǎn)在生物學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用20-22
• 1.4 主要研究?jī)?nèi)容及意義22-23
• 1.4.1 主要研究?jī)?nèi)容22
• 1.4.2 研究意義22-23
• 第2章 抗c-Myc納米抗體的淘選及鑒定23-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器23-25
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑23-24
• 2.1.2 溶液配制24-25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器25
• 2.2 方法與步驟25-29
• 2.2.1 輔助噬菌體M13K07滴度測(cè)定及擴(kuò)增25-26
• 2.2.2 抗c-Myc蛋白抗體噬菌體文庫(kù)的淘選26-28
• 2.2.3 陽(yáng)性噬菌體的鑒定及分析28-29
• 2.3 結(jié)果與分析29-34
• 2.3.1 抗c-Myc蛋白抗體的親和淘選29-31
• 2.3.2 陽(yáng)性噬菌體的鑒定31-33
• 2.3.3 陽(yáng)性噬菌體的序列分析33-34
• 2.4 討論與小結(jié)34-36
• 2.4.1 討論34-35
• 2.4.2 小結(jié)35-36
• 第3章 抗c-Myc納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)及活性初探36-54
• 3.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器36-38
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑36-37
• 3.1.2 溶液配制37-38
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器38
• 3.2 方法與步驟38-47
• 3.2.1 陽(yáng)性噬菌體相對(duì)親和力的比較38-39
• 3.2.2 質(zhì)粒的提取39
• 3.2.3 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備39-40
• 3.2.4 pET25b-Myc表達(dá)載體的構(gòu)建40-43
• 3.2.5 抗c-Myc納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)43-44
• 3.2.6 SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗體蛋白的表達(dá)44-45
• 3.2.7 抗體蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化45
• 3.2.8 抗體蛋白的活性分析45-47
• 3.3 結(jié)果與分析47-52
• 3.3.1 陽(yáng)性噬菌體相對(duì)親和力的比較47
• 3.3.2 獲得目的基因47-49
• 3.3.3 構(gòu)建pET25-Myc表達(dá)載體49-50
• 3.3.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)50
• 3.3.5 目的蛋白活性的鑒定50-51
• 3.3.6 目的蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化51-52
• 3.4 討論與小結(jié)52-54
• 3.4.1 討論52-53
• 3.4.2 小結(jié)53-54
• 第4章 量子點(diǎn)熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)myc蛋白表達(dá)初探54-62
• 4.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器54-55
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑54-55
• 4.1.2 溶液配制55
• 4.2 方法與步驟55-57
• 4.2.1 細(xì)胞爬片制備55-56
• 4.2.2 量子點(diǎn)間接免疫熒光法對(duì)細(xì)胞內(nèi)myc蛋白檢測(cè)56
• 4.2.3 量子點(diǎn)直接免疫熒光法對(duì)細(xì)胞內(nèi)myc蛋白檢測(cè)56-57
• 4.3 結(jié)果與分析57-60
• 4.3.1 量子點(diǎn)間接免疫熒光法對(duì)胞內(nèi)myc蛋白特異性標(biāo)記57-59
• 4.3.2 量子點(diǎn)直接免疫熒光法對(duì)胞內(nèi)myc蛋白特異性標(biāo)記59-60
• 4.4 討論與小結(jié)60-62
• 4.4.1 討論60-61
• 4.4.2 小結(jié)61-62
• 第5章 主要研究結(jié)果與展望62-63
• 5.1 主要研究結(jié)果62
• 5.2 進(jìn)一步工作方向62-63
• 致謝63-64
• 參考文獻(xiàn)64-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 孔波;劉惠;楊勝利;馬維駿;;大分子量重組蛋白在絲狀噬菌體表面的展示表達(dá)及其與小分子相互作用的初步研究[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年01期

2 江漢民;柴新君;何冰;趙娟;俞新大;;ProNGF在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和復(fù)性[J];生物工程學(xué)報(bào);2008年03期

  本文關(guān)鍵詞：抗c-Myc納米抗體的淘選、表達(dá)及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：295398