本文關(guān)鍵詞：抗c-Myc納米抗體的淘選、表達及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細胞中,存在著一類基因或者是基因家族,其在通常情況下為抑制狀態(tài)或維持較低表達水平,當其在某些因素作用下,基因表達失去控制,細胞的正常生物學性狀會發(fā)生各種改變,逐步轉(zhuǎn)化成為惡性細胞,最終導(dǎo)致細胞甚至機體癌變。這類基因我們通常稱之為原癌基因(Proto-oncogene)。myc基因家族為原癌基因家族中的一類,主要分為c-myc、n-myc、l-myc三類基因。myc基因家族及其產(chǎn)物主要與調(diào)控細胞周期的DNA結(jié)合,控制細胞的增殖以及誘導(dǎo)細胞的凋亡。研究認為,腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移同c-myc基因的激活有密切關(guān)系。量子點(QDs)是由II-VI族或III-V族元素組成的半導(dǎo)體材料,屬于納米晶體,受激后能發(fā)射熒光,可用于生物學分析。量子點激發(fā)光譜寬,同時發(fā)射光譜窄并且左右對稱,可以通過改變粒子大小控制熒光發(fā)射波長。與傳統(tǒng)有機熒光染料相比,量子點具有很高的量子產(chǎn)率和抗光漂白能力,而且熒光壽命長,具有良好的生物相容性。因此,量子點熒光技術(shù)在生物學領(lǐng)域具有廣闊前景。本研究采用噬菌體展示技術(shù),從羊駝免疫庫中淘選能與c-Myc結(jié)合的納米抗體,并將淘選獲得的抗c-Myc納米抗體在大腸桿菌中進行表達,純化的重組抗c-Myc納米抗體經(jīng)量子點標記后,初步用于檢測細胞內(nèi)c-Myc蛋白的表達情況,主要研究結(jié)果如下:1、通過四輪固相淘選,從羊駝c-Myc蛋白免疫文庫中獲得了了11個能特異性結(jié)合c-Myc蛋白的克隆,分別為A13、A18、A25、A26、A31、A32、B34、C5、C24、C42、C46,并對這些克隆的親和力大小進行了分析比較。2、選取親和力相對較高的克隆(A25和A26),分別將編碼基因克隆至表達載體pET-25b(+),在大腸桿菌表達系統(tǒng)中,使用IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,重組蛋白分子量約20 kDa,與預(yù)期分子大小相符。3、初步驗證了利用量子點標記重組納米抗體用于細胞內(nèi)靶標檢測的方法。制備SP2/0細胞爬片,用量子點熒光標記納米抗體,檢測c-Myc蛋白在細胞內(nèi)表達,加入納米抗體及量子點后,細胞顯示熒光,單純加入量子點,無熒光反應(yīng),本研究得到的納米抗體有望實現(xiàn)對細胞內(nèi)c-Myc蛋白表達情況檢測。
【關(guān)鍵詞】：納米抗體 c-Myc ELISA 量子點
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 縮略語6-12
• 第1章 前言12-23
• 1.1 原癌基因myc概況12-17
• 1.1.1 原癌基因12
• 1.1.2 原癌基因分類12-13
• 1.1.3 myc基因的結(jié)構(gòu)與功能13-15
• 1.1.4 c-Myc蛋白的作用機制15-17
• 1.1.5 c-myc與腫瘤17
• 1.2 c-myc在檢測中的研究進展17-19
• 1.2.1 基于c-myc基因的檢測方法17-18
• 1.2.2 基于c-Myc蛋白的檢測方法18
• 1.2.3 c-Myc作為蛋白融合標簽的應(yīng)用18-19
• 1.3 量子點概述19-22
• 1.3.1 量子點定義19
• 1.3.2 量子點光學特征19-20
• 1.3.3 量子點在生物學檢測中的應(yīng)用20-22
• 1.4 主要研究內(nèi)容及意義22-23
• 1.4.1 主要研究內(nèi)容22
• 1.4.2 研究意義22-23
• 第2章 抗c-Myc納米抗體的淘選及鑒定23-36
• 2.1 實驗試劑與儀器23-25
• 2.1.1 實驗試劑23-24
• 2.1.2 溶液配制24-25
• 2.1.3 實驗儀器25
• 2.2 方法與步驟25-29
• 2.2.1 輔助噬菌體M13K07滴度測定及擴增25-26
• 2.2.2 抗c-Myc蛋白抗體噬菌體文庫的淘選26-28
• 2.2.3 陽性噬菌體的鑒定及分析28-29
• 2.3 結(jié)果與分析29-34
• 2.3.1 抗c-Myc蛋白抗體的親和淘選29-31
• 2.3.2 陽性噬菌體的鑒定31-33
• 2.3.3 陽性噬菌體的序列分析33-34
• 2.4 討論與小結(jié)34-36
• 2.4.1 討論34-35
• 2.4.2 小結(jié)35-36
• 第3章 抗c-Myc納米抗體的誘導(dǎo)表達及活性初探36-54
• 3.1 實驗試劑與儀器36-38
• 3.1.1 實驗試劑36-37
• 3.1.2 溶液配制37-38
• 3.1.3 實驗儀器38
• 3.2 方法與步驟38-47
• 3.2.1 陽性噬菌體相對親和力的比較38-39
• 3.2.2 質(zhì)粒的提取39
• 3.2.3 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備39-40
• 3.2.4 pET25b-Myc表達載體的構(gòu)建40-43
• 3.2.5 抗c-Myc納米抗體的誘導(dǎo)表達43-44
• 3.2.6 SDS-PAGE電泳檢測抗體蛋白的表達44-45
• 3.2.7 抗體蛋白表達條件的優(yōu)化45
• 3.2.8 抗體蛋白的活性分析45-47
• 3.3 結(jié)果與分析47-52
• 3.3.1 陽性噬菌體相對親和力的比較47
• 3.3.2 獲得目的基因47-49
• 3.3.3 構(gòu)建pET25-Myc表達載體49-50
• 3.3.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達50
• 3.3.5 目的蛋白活性的鑒定50-51
• 3.3.6 目的蛋白表達條件的優(yōu)化51-52
• 3.4 討論與小結(jié)52-54
• 3.4.1 討論52-53
• 3.4.2 小結(jié)53-54
• 第4章 量子點熒光技術(shù)檢測細胞內(nèi)myc蛋白表達初探54-62
• 4.1 實驗試劑與儀器54-55
• 4.1.1 實驗試劑54-55
• 4.1.2 溶液配制55
• 4.2 方法與步驟55-57
• 4.2.1 細胞爬片制備55-56
• 4.2.2 量子點間接免疫熒光法對細胞內(nèi)myc蛋白檢測56
• 4.2.3 量子點直接免疫熒光法對細胞內(nèi)myc蛋白檢測56-57
• 4.3 結(jié)果與分析57-60
• 4.3.1 量子點間接免疫熒光法對胞內(nèi)myc蛋白特異性標記57-59
• 4.3.2 量子點直接免疫熒光法對胞內(nèi)myc蛋白特異性標記59-60
• 4.4 討論與小結(jié)60-62
• 4.4.1 討論60-61
• 4.4.2 小結(jié)61-62
• 第5章 主要研究結(jié)果與展望62-63
• 5.1 主要研究結(jié)果62
• 5.2 進一步工作方向62-63
• 致謝63-64
• 參考文獻64-68

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 孔波;劉惠;楊勝利;馬維駿;;大分子量重組蛋白在絲狀噬菌體表面的展示表達及其與小分子相互作用的初步研究[J];生物工程學報;2006年01期

2 江漢民;柴新君;何冰;趙娟;俞新大;;ProNGF在大腸桿菌中的表達、純化和復(fù)性[J];生物工程學報;2008年03期

  本文關(guān)鍵詞：抗c-Myc納米抗體的淘選、表達及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：295398