本文關(guān)鍵詞：重編程過程中使用抗氧化劑降低人iPSCs基因組變異，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 人類胚胎干(ES)細(xì)胞具有在體外無限增殖和分化為多種細(xì)胞的潛能,可為再生醫(yī)學(xué)的替代療法提供充足的細(xì)胞來源。然而由于入ES細(xì)胞的分離涉及到倫理問題,從而限制了ES細(xì)胞的研究以及在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。2006年,日本京都大學(xué)山中伸彌(Shinya Yamanaka)團(tuán)隊(duì)通過向小鼠皮膚成纖維細(xì)胞導(dǎo)入以逆病毒為載體的4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、SOX2、c-Myc、Klf4,將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)。iPSCs和ES細(xì)胞功能類似,可以在體外無限增殖并具有多向分化能力。重編程技術(shù)繞開了ES細(xì)胞研究一直面臨的倫理障礙,在生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面具有重大的潛在價(jià)值,因而成為了當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。但是,多個(gè)小組的研究表明iPSCs的基因組存在變異,基因變異可能使移植的細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤,從而限制了iPSCs的應(yīng)用。然而目前關(guān)于人iPSCs基因組變異的原因大部分未知。我們的課題證明了人體細(xì)胞重編程過程中存在氧化應(yīng)激,在誘導(dǎo)iPSCs產(chǎn)生過程中的培養(yǎng)基中添加抗氧化劑可以降低人iPSCs基因組的變異。我們的研究結(jié)果表明,可通過在誘導(dǎo)產(chǎn)生和維持iPSCs的培養(yǎng)基中添加抗氧化劑來提高人類iPSCs的質(zhì)量和安全性,從而為獲得更安全的iPSCs應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)提供一定的參考價(jià)值。本研究分為兩個(gè)部分：1)人體細(xì)胞重編程誘導(dǎo)成iPSCs系統(tǒng)的建立；2)人體細(xì)胞重編程過程中加入抗氧化劑降低iPSCs基因組變異的研究。 第一部分人體細(xì)胞重編程系統(tǒng)的建立 目的：建立人類成纖維細(xì)胞或者尿液細(xì)胞重編程為iPSCs的體系,為研究作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。 方法：重編程四因子OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC以PMX逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導(dǎo)入到目的細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)成iPSCs,挑選克隆后繼續(xù)培養(yǎng),傳代和擴(kuò)增,并對其進(jìn)行鑒定如ES細(xì)胞特異標(biāo)記分子的表達(dá)和體外細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)明確獲得成熟的iPSCs。 結(jié)果：在人尿液來源的細(xì)胞和人的皮膚成纖維細(xì)胞成功導(dǎo)入重編程四因子后均可觀察到明顯的細(xì)胞形變,經(jīng)檢測為ALP陽性。 結(jié)論：通過以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導(dǎo)入特定轉(zhuǎn)錄因子的經(jīng)典方法可以使人尿液來源的細(xì)胞和人的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs. 第二部分體細(xì)胞重編程過程中使用抗氧化劑降低基因組變異 目的：人iPSCs的基因組存在變異阻礙iPSCs在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。因此明確導(dǎo)致人iPSCs基因組變異的原因并發(fā)明方法以減少其變異,對于獲得安全的iPSCs用于再生醫(yī)學(xué)非常重要。本研究旨在探究人體細(xì)胞重編程過程中氧化自由基應(yīng)激是否是導(dǎo)致人iPSCs基因組變異的重要原因,加入抗氧化劑是否可以減少iPSCs基因組變異。 方法：在重編程過程中檢測ROS以及DNA損傷水平,并對比加入抗氧化劑后對ROS, DNA損傷和人iPSCs基因組變異的作用。 結(jié)果：相對于對照組,添加抗氧化劑可以顯著降低ROS和DNA損傷水平,加入抗氧化劑后獲得的iPSCs具有較少的基因組拷貝數(shù)變異。 結(jié)論：添加抗氧化劑可降低人iPSCs基因組的變異。
【關(guān)鍵詞】：抗氧化劑 體細(xì)胞重編程 基因組變異 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞10-14
• 引言14-16
• 1 第一章 iPSCs系統(tǒng)建立16-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器16-21
• 1.1.1 材料和試劑16-17
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料17-18
• 1.1.3 相關(guān)試劑的配制18-21
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法21-29
• 1.2.1 支原體檢測21-22
• 1.2.2 人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)的分離和培養(yǎng)22
• 1.2.3 人尿液細(xì)胞(UC)的分離和培養(yǎng)22-23
• 1.2.4 iPSCs細(xì)胞的培養(yǎng)23
• 1.2.5 MEF細(xì)胞的分離和培養(yǎng)23-24
• 1.2.6 MEF飼養(yǎng)層處理24
• 1.2.7 細(xì)胞凍存24
• 1.2.8 細(xì)胞復(fù)蘇24-25
• 1.2.9 重編程步驟方法25
• 1.2.10 感受態(tài)細(xì)胞的制備25-26
• 1.2.11 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化26
• 1.2.12 質(zhì)粒大量抽提26-27
• 1.2.13 病毒包裝27-28
• 1.2.14 病毒感染28
• 1.2.15 BCIP/NBT堿性磷酸酯酶染色28-29
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-36
• 1.3.1 獲得人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞流程圖29
• 1.3.2 支原體檢測結(jié)果29-30
• 1.3.3 成功分離P0代人尿液細(xì)胞30-31
• 1.3.4 293T成功轉(zhuǎn)染質(zhì)粒PMX-GFP31-32
• 1.3.5 pMX-GFP成功感染尿液細(xì)胞32-33
• 1.3.6 感染四因子后尿液細(xì)胞的形變變化33-34
• 1.3.7 感染四因子后成纖維細(xì)胞的形變變化34-35
• 1.3.8 感染四因子后外源因子的表達(dá)35
• 1.3.9 ES樣細(xì)胞出現(xiàn)35-36
• 1.4 討論36-37
• 2 第二章 體細(xì)胞重編程過程中使用抗氧化劑降低基因組變異37-51
• 2.1 材料和試劑37
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料37
• 2.1.2 相關(guān)試劑配制37
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法37-41
• 2.2.1 提取RNA37-38
• 2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA38
• 2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time PCR)38-39
• 2.2.4 γH2AX免疫熒光染色39-40
• 2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡40
• 2.2.6 MTT assay40-41
• 2.2.7 Southern Blot測定逆轉(zhuǎn)錄病毒整合41
• 2.2.8 其余方法同第一章41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-50
• 2.3.1 添加NAC實(shí)驗(yàn)流程圖41-42
• 2.3.2 添加抗氧化劑對ROS水平、基因損傷和細(xì)胞存活的影響42-47
• 2.3.3 添加抗氧化劑對重編程效率的影響47-48
• 2.3.4 添加抗氧化劑對基因組變異的影響48-50
• 2.4 討論50-51
• 總結(jié)51-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 綜述56-67
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果67

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張萍;馬月輝;焦淑清;關(guān)偉軍;;誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞研究及臨床應(yīng)用[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2015年08期

2 徐方平,羅健東;活性氧與心肌細(xì)胞凋亡[J];華北國防醫(yī)藥;2003年02期

3 姜文;何慶;;百草枯急性肺損傷中毒機(jī)制的研究進(jìn)展[J];華西醫(yī)學(xué);2006年03期

4 沈傳陸,朱俊;Prx1高表達(dá)對人PC3前列腺癌細(xì)胞氧化損傷的作用[J];東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年06期

5 張先平;張貴海;陳斌;劉俊;魏強(qiáng);王璐;王亞平;;氧化低密度脂蛋白通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠造血干細(xì)胞衰老[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2013年02期

6 王含彥;宋永燕;陳建業(yè);;鉀離子與血管鈣化調(diào)節(jié)研究進(jìn)展[J];中華老年心腦血管病雜志;2012年03期

7 王清;寧璇璇;裴東;趙建民;由麗萍;王春艷;吳惠豐;;Molecular cloning, characterization and expression profiles of thioredoxin 1 and thioredoxin 2 genes in Mytilus galloprovincialis[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2013年03期

8 汪涵;陳卓;;轉(zhuǎn)錄因子Klf4在人牙髓組織和牙髓成纖維細(xì)胞中的表達(dá)研究[J];口腔醫(yī)學(xué);2013年09期

9 XIE ShuJuan;ZHANG Yin;QU LiangHu;XU Hui;;A Helm model for microRNA regulation in cell fate decision and conversion[J];Science China(Life Sciences);2013年10期

10 甘鵬;熊亮;賈文超;潘傳英;藍(lán)賢勇;陳宏;;牛c-Myc/TAT/9R融合表達(dá)載體構(gòu)建及其原核表達(dá)研究[J];家畜生態(tài)學(xué)報(bào);2013年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 ;Oxidative Stress and Apoptotic Changes of Rat Cerebral Cortical Neurons Exposed to Cadmium in Vitro[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜內(nèi)科學(xué)分會第七屆代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2011年

2 王薇;熊微;萬江陵;徐輝碧;楊祥良;;聚乙二醇修飾降低聚酰胺-胺樹狀大分子細(xì)胞毒性的機(jī)理研究(英文)[A];第十屆中國科協(xié)年會論文集（三）[C];2008年

3 陳承志;Xuejun Jiang;Wenwen Deng;Yanan Hu;Zunzhen Zhang;;白藜蘆醇對三氧化二砷毒性的保護(hù)作用由谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)和線粒體、死亡受體凋亡的多路徑調(diào)控(英文)[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會（生物醫(yī)藥專題）論文集（上冊，大會報(bào)告）[C];2013年

4 周燦權(quán);李宇彬;;研究中的生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)[A];中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會第二次全國生殖臨床學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2012年

5 張可華;袁寶珠;;治療性干細(xì)胞產(chǎn)品相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素[A];2012年中國藥學(xué)大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

6 種朝陽;臧偉進(jìn);周筠;;iPSCs在心律失常疾病體外模型方面的研究進(jìn)展[A];全國第十三屆心臟學(xué)會、第十六屆心功能專業(yè)委員會和《心臟雜志》編委會聯(lián)合學(xué)術(shù)大會會議紀(jì)要[C];2013年

7 蔡杰;李慧;楊焰;荊小莉;魏紅艷;胡春林;廖曉星;李欣;;iPS-MSCs通過調(diào)節(jié)CD4~+ CD25~+ Foxp3~+ T細(xì)胞改善心臟驟停后全身免疫反應(yīng)[A];《中華急診醫(yī)學(xué)雜志》第十三屆組稿會暨第六屆急診醫(yī)學(xué)青年論壇論文匯編[C];2014年

8 宋媛媛;張寧;尹瑞川;尹俊發(fā);汪海林;;熒光修飾抗壞血酸酯的合成及細(xì)胞成像分析[A];第十屆全國生物醫(yī)藥色譜及相關(guān)技術(shù)學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2014年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李偉;PP2A抑制劑對胰腺癌細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 趙景霞;納米氧化鋅對海馬神經(jīng)元電生理特性的影響及對PC12細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制研究[D];南開大學(xué);2010年

3 江筠;蓮藕中抗氧化成分的抗HIV-1活性及其作用機(jī)制研究[D];南開大學(xué);2010年

4 漆永梅;錯(cuò)配修復(fù)蛋白hMLH1在硒化合物誘導(dǎo)DNA損傷應(yīng)答途徑中的作用[D];蘭州大學(xué);2011年

5 蔣偉忠;基于危險(xiǎn)度分層差異的胃腸間質(zhì)瘤比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

6 孫國貴;錳超氧化物歧化酶表達(dá)特性與食管癌關(guān)系的臨床基礎(chǔ)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

7 趙延濤;LPS致流產(chǎn)作用及保胎中藥的調(diào)控效應(yīng)研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

8 周鑫才;等離子體射流聯(lián)合刮治術(shù)治療犬種植體周圍炎的實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2012年

9 李建明;線粒體在活性氧誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

10 胡宇;砷誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化分子機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2002年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄒鑫森;27例百草枯中毒的臨床分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

2 王牡;姜黃素誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的研究[D];暨南大學(xué);2011年

3 許小萍;氧化應(yīng)激在羅哌卡因所致大鼠脊髓神經(jīng)毒性中的作用及其機(jī)制[D];中南大學(xué);2011年

4 郭成志;三聚氰胺致NRK-52e細(xì)胞氧化應(yīng)激與p38MAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

5 張麗;白花丹素對黑素瘤A375細(xì)胞體外增殖及凋亡的影響[D];華中科技大學(xué);2010年

6 劉冠蘭;蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶的抗氧化功能研究[D];清華大學(xué);2010年

7 朱昱燕;不同非生物因子對大久保桃果實(shí)采后品質(zhì)以及活性氧代謝的影響[D];北京工商大學(xué);2010年

8 王偉;百草枯中毒致肺纖維化病變區(qū)域分布的影像學(xué)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

9 孟煥成;百草枯中毒機(jī)制及治療進(jìn)展[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

10 李峰;小麥—條銹菌互作過程中的活性氧和Ca~(2+)功能的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

  本文關(guān)鍵詞：重編程過程中使用抗氧化劑降低人iPSCs基因組變異，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：295294