本文關(guān)鍵詞：光遺傳學技術(shù)在眨眼條件反射研究中的初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：條件反射行為的研究歷史長達一百年之久,其中眨眼條件反射行為是最簡單,也是應用最廣泛的聯(lián)合學習記憶模型之一。經(jīng)典的眨眼條件反射(Eyeblink conditioning, EBC)通常分為delay及trace兩種模式,一般而言,以外周刺激(如視覺或聽覺刺激)作為條件刺激(Conditioned Stimulus, CS)來建立眨眼條件反射模型；同時,我們也發(fā)現(xiàn)一些以電刺激外周視聽信號上傳路徑所途經(jīng)(中繼)的局部腦區(qū)(或核團)作為條件刺激均成功建立了EBC的報告。已有研究提示前額葉在某些情況下參與了眨眼條件反射delay模式的建立或表達。這對傳統(tǒng)的結(jié)論----前額葉不參與delay模式提出了挑戰(zhàn),對此我們也非常感興趣,為什么在某些特殊情況下delay模式需要前額葉參與?因此,我們選擇了前額葉中分布最多的谷氨酸能神經(jīng)元作為研究靶點來探索谷氨酸能神經(jīng)元參與眨眼條件反射(delay模式)的神經(jīng)機制。光遺傳學技術(shù)是通過基因工程的方法將目標光通道敏感基因包裝到相關(guān)病毒上,并將其轉(zhuǎn)染到動物的某一類神經(jīng)元上,在完成一系列的分子生物學過程后光敏蛋白最終表達在特定細胞的細胞膜上,同時依據(jù)不同的光敏蛋白(如ChR2)的不同特性,實現(xiàn)對某一類型細胞或神經(jīng)元精確至毫秒級的高分辨率調(diào)控的一門革命性技術(shù)。由于光遺傳學的獨特優(yōu)勢,光遺傳學為我們驗證delay-EBC在某些情況下可能需要前額葉谷氨酸能神經(jīng)元參與的推測提供了目前為止最優(yōu)的方法。通過Pubmed的檢索,至今尚未發(fā)現(xiàn)以光刺激大腦內(nèi)某一類神經(jīng)元作為CS并成功建立EBC的報告。由此,我們采用光遺傳學技術(shù)特異操控內(nèi)側(cè)前額葉(medial prefrontal cortex, mPFC)的谷氨酸能神經(jīng)元,’并以光激活這一群谷氨酸能神經(jīng)元作為CS,從而探討此方式是否能成功建立delay-EBC及可能的內(nèi)在神經(jīng)機制。材料和方法：通過立體定向注射手段,把攜帶有細胞特異性啟動子的視蛋白腺相關(guān)病毒AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry注射到mPFC。病毒注射3～4周后,一方面通過熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡來判斷神經(jīng)元膜表面是否表達有紅色熒光蛋白,以及其表達位置是否在mPFC,從而判斷光敏基因在谷氨酸能神經(jīng)元表達的特異性。并利用在體細胞外記錄技術(shù)觀察表達AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry的谷氨酸能神經(jīng)元對不同光刺激頻率的反應特性,用以了解ChR2的通道生理功能,為行為學研究奠定基礎(chǔ)。另一方面經(jīng)操控已經(jīng)表達在自由活動動物mPFC谷氨酸能神經(jīng)元上的ChR2通道完成行為學實驗：待病毒AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry靶向注射到大鼠右側(cè)nPFC 4周后通過手術(shù)建立光神經(jīng)界面,并預留打藥孔,分別用藍光(470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬,20 Hz)激活mPFC谷氨酸能神經(jīng)元作為CS,電刺激眼輪匝肌作為US,觀察是否能建立delay-EBC;待條件行為建立完成后以微注射技術(shù)向mPFC光照射部位注射短時失活藥物muscimol (GABA-A受體激動劑,氯離子通道開放導致氯離子大量進入細胞而達到失活細胞的目的),觀察對delay-DEC的影響。結(jié)果：(1)病毒成功注射到mPFC,94.6 ±0.9%的CaMKIIa表達的谷氨酸能神經(jīng)元表達ChR2-mCherry蛋白,并且表達ChR2-mCherry蛋白的細胞98.87士0.3%是谷氨酸能神經(jīng)元,提示在CamKⅡ a啟動子控制下,腺相關(guān)病毒載體可將光敏基因特異性的表達于谷氨酸能神經(jīng)元(2)表達有ChR2-mCherry蛋白的谷氨酸能神經(jīng)元對藍光(470 nm, 20 mW/mm2,5 ms波寬,5-80 Hz)產(chǎn)生穩(wěn)定的反應,對低頻光刺激(5、10和20Hz)的反應性優(yōu)于高頻光刺激(40和80Hz)。(3)以藍光(470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬,20 Hz)激活mpfc谷氨酸能神經(jīng)元為CS的條件下,大鼠能成功建立眨眼條件反射行為,通過靶向微注射muscimol能明顯影響delay-EBC的條件反應(conditioned response, CR)的表達。結(jié)論：通過一系列的努力探索終于成功構(gòu)建了眨眼條件反射的光遺傳學平臺,我們發(fā)現(xiàn)特異性激活mPFC的一群谷氨酸能神經(jīng)元作為CS能成功建立delay-EBC,證明了我們之前推測的合理性。因此,本實驗成功完成的意義不僅僅局限在技術(shù)平臺的建立,而是特別有利于推動自由活動動物在體條件下對聯(lián)合性學習記憶的神經(jīng)細胞機制的進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：谷氨酸能神經(jīng)元 眨眼條件反射 光遺傳學 內(nèi)側(cè)前額葉
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R338
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 1 材料和方法15-26
• 2 實驗結(jié)果26-34
• 3 討論34-37
• 4 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-41
• 文獻綜述41-49
• 參考文獻46-49
• 致謝49-50
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文50

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本文編號：288425