本文關(guān)鍵詞：黃綠青霉素通過ROS介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:黃綠青霉素(citreoviridin,CIT)是由發(fā)霉谷物產(chǎn)生出的次級代謝產(chǎn)物,例如玉米、大米等。研究發(fā)現(xiàn)黃綠青霉素在大米中生長速度最快,產(chǎn)毒數(shù)量最高。很多大米消費(fèi)水平高的發(fā)展中國家由于溫度較高、氣候潮濕等儲物條件有利于真菌的生長和毒素的產(chǎn)生,因此在這些國家黃綠青霉素污染較嚴(yán)重,成為一個不可忽視的重大的公共衛(wèi)生問題。黃綠青霉素已經(jīng)被證實(shí)與多種疾病有關(guān)。肝臟是解毒的重要器官也是很多真菌毒素的靶器官。動物攝入的黃綠青霉素主要集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟和心臟。黃綠青霉素肝臟毒性的分子機(jī)制尚未完全明確。細(xì)胞自噬是近些年來的研究熱點(diǎn),自噬是指細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)包裹于雙層或多層膜結(jié)構(gòu),形成自噬小體,而自噬小體與溶酶體融合并對其內(nèi)容物進(jìn)行消化的過程。正常水平的自噬是一種通過降解胞內(nèi)異常組分以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的機(jī)制,然而自噬水平過度上調(diào)則引起細(xì)胞自噬性死亡。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谘芯奎S綠青霉素是否改變了細(xì)胞自噬的過程及自噬在黃綠青霉素肝臟毒性中所發(fā)揮的作用,是保護(hù)肝臟細(xì)胞還是促進(jìn)肝臟細(xì)胞的死亡。本研究可以進(jìn)一步加深對黃綠青霉素肝臟毒性分子機(jī)制的理解。方法:本實(shí)驗(yàn)以Hep G2細(xì)胞作為研究對象。用MTT(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法)檢測不同劑量黃綠青霉素處理后的Hep G2細(xì)胞存活率的變化;預(yù)先使用不同試劑(自噬抑制劑3-MA、自噬激活劑雷帕霉素、si RNA Atg5、活性氧抑制劑NAC)處理后,用黃綠青霉素處理Hep G2細(xì)胞,檢測細(xì)胞存活率的變化;用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體的超微結(jié)構(gòu);用熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID#174;Green染色的自噬小體熒光強(qiáng)弱的變化;用Western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡法)檢測黃綠青霉素處理的LC3(細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記物-微管相關(guān)蛋白輕鏈3)和P62蛋白表達(dá)量的變化;用LC3-turnover實(shí)驗(yàn)鑒別細(xì)胞內(nèi)聚集的自噬小體是由自噬小體增多所致,還是由自噬小體降解障礙所致;用DCFH-DA(2’,7’-二氫二氯熒光素)檢測不同劑量黃綠青霉素處理的細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化。結(jié)果:經(jīng)過不同濃度黃綠青霉素(0?M、1.25?M、2.5?M、5?M)染毒24小時后,隨著CIT濃度的增加Hep G2細(xì)胞存活率明顯下降;用自噬抑制劑3-MA(3-Methyladenine)、ROS(Reactive oxygen species,活性氧)抑制劑NAC(N-乙酰半胱氨酸)和si RNA Atg5干預(yù)后,細(xì)胞存活率與對照組相比明顯增高;用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理4小時,細(xì)胞存活率與對照組相比明顯下降。用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化可進(jìn)一步證實(shí)以上結(jié)論。電子顯微鏡下可明顯觀察到自噬小體的雙層或多層膜結(jié)構(gòu),且自噬小體數(shù)量增加。熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)的自噬小體隨著黃綠青霉素劑量升高而逐漸增多。LC3-II蛋白表達(dá)隨黃綠青霉素濃度增加而增加,P62蛋白表達(dá)隨黃綠青霉素濃度增加而減少;在LC3-turnover實(shí)驗(yàn)中,用自噬小體與溶酶體融合的抑制劑Cq(chloroquine,氯喹)處理后,與對照組相比LC3-II蛋白表達(dá)量明顯增多,這說明聚集的自噬小體是由自噬小體生成增多所致,而不是由自噬小體降解障礙引起;用活性氧ROS抑制劑NAC預(yù)處理1小時后,與對照組相比LC3-II蛋白表達(dá)量明顯減少。細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨黃綠青霉素劑量的升高而升高;用ROS抑制劑NAC預(yù)處理Hep G2細(xì)胞可有效降低活性氧水平,并可以逆轉(zhuǎn)黃綠青霉素的細(xì)胞毒性。結(jié)論:黃綠青霉素可在Hep G2細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)自噬小體的形成。在黃綠青霉素的肝臟毒性中,細(xì)胞自噬是細(xì)胞死亡的主要原因,而黃綠青霉素誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡主要依賴于活性氧的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：黃綠青霉素 自噬 活性氧 人肝癌HepG2細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• （一）前言12-13
• （二）材料和方法13-21
• 1. 材料13-15
• 1.1 藥品和主要試劑13-14
• 1.2 主要儀器14-15
• 2. 方法15-21
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理15
• 2.2 RNA干擾15-16
• 2.3 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)16
• 2.4 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體16-17
• 2.5 熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞的自噬小體17-18
• 2.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）18-20
• 2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS測定20-21
• 2.8 統(tǒng)計方法21
• （三）結(jié)果21-32
• 1. 黃綠青霉素引起Hep G2細(xì)胞死亡21-25
• 2. 黃綠青霉素引起Hep G2細(xì)胞自噬小體的聚集25-27
• 3. 黃綠青霉素增加HepG2細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II的表達(dá)水平同時減少自噬底物P62的表達(dá)水平27-29
• 4. 黃綠青霉素增加Hep G2細(xì)胞中的自噬小體數(shù)量29-30
• 5. NAC降低了經(jīng)黃綠青霉素處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS和LC3-II的表達(dá)量30-32
• （四）討論32-34
• （五）結(jié)論34-35
• （六）參考文獻(xiàn)35-40
• 綜述40-50
• 參考文獻(xiàn)45-50
• 附錄50-51
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況51-52
• 致謝52-53

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 侯海峰;黃綠青霉素致血管內(nèi)皮毒性機(jī)理和對動脈粥樣硬化發(fā)病的影響[D];山東大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉亞楠;黃綠青霉素通過ROS介導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬性死亡的實(shí)驗(yàn)研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

2 周汝;黃綠青霉素對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡作用研究[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2013年

3 闕善進(jìn);黃綠青霉素人工抗原的制備及酶聯(lián)免疫吸附法的建立[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

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本文編號：288415