本文關(guān)鍵詞：毛細(xì)管區(qū)帶電泳法快速分離珠蛋白肽鏈及其應(yīng)用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景與目的血紅蛋白是機體生存必需的功能蛋白,分子質(zhì)量約為64.5KDa,是紅細(xì)胞內(nèi)氧及二氧化碳的載體。人體血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)呈球形,內(nèi)部有四個含氧血紅素,每個血紅素與相應(yīng)肽鏈之間由共價鍵相連。人體血紅蛋白是由2條α類肽鏈和2條β類肽鏈非共價結(jié)合形成的四聚體,α類肽鏈包括ζ鏈和α-鏈,β類肽鏈包括￡-鏈、γ-鏈、δ-鏈、β-鏈。機體在不同發(fā)育階段對氧氣的需求是不同的,因此不同發(fā)育階段的血紅蛋白肽鏈組成也有所不同。Hb Gower 1(ζ2ε2).Hb Gower 2 (α2ε2)、Hb Portland(ζ2γ2)是人體胚胎期血紅蛋白的主要類型；隨著妊娠進程,ζ、ε-珠蛋白基因表達開始減少,γ-珠蛋白基因表達增加,HbF(α2γ2)成為胎兒期的主要血紅蛋白,同時機體有少量的HbA2(α2δ2)產(chǎn)生；γ-珠蛋白基因在出生前后關(guān)閉,β-珠蛋白基因表達在1歲后達到高峰并維持終生,因此成人期的主要血紅蛋白類型為HbA(α2β2).HbA2α2δ2)。血紅蛋白病是一類由珠蛋白結(jié)構(gòu)異常或者合成不足引起的遺傳性疾病,主要分為地中海貧血(簡稱“地貧”)和異常血紅蛋白。地貧主要是因為珠蛋白基因異常,使珠蛋白肽鏈合成受到抑制而導(dǎo)致類α肽鏈和類β肽鏈?zhǔn)Ш獾囊唤M遺傳性溶血性疾病。根據(jù)α-和β-鏈?zhǔn)Ш獬潭瓤煞譃橐韵氯悾?一)地貧基因攜帶者,此類個體常無明顯的臨床癥狀。α-地貧基因攜帶者基因型多為α/αα,ααΥ/αα αΥα/αα,-α/-α,-α/αΥα;β-地貧基因攜帶者常見基因型為β+/βN,β0/βN。(二)中間型地貧：該型臨床表型嚴(yán)重程度不同,貧血程度也有很大差別。中間型α-地貧又稱Hb H病,此類患者基因型多為--/-α或--/αTα。而中間型p-地貧患者的基因型多為β+/β+,β+/β0,β-地貧復(fù)合HPFH,6p-地貧。(三)重型地貧：該型包括重型α-地貧和重型p-地貧。由于重型α-地貧四個α-珠蛋白基因缺如,γ-珠蛋白相對過剩,聚集產(chǎn)生Hb Bart's(γ4),又稱Hb Bart's胎兒水腫綜合征,其基因型為--/--。重型p-地貧的基因型為β0/β+,β0/β0。異常血紅蛋白則是因為珠蛋白鏈的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致相應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)、功能、合成和/或穩(wěn)定性產(chǎn)生改變的一組遺傳性疾病。表型研究在異常血紅蛋白疾病的診斷以及病情預(yù)判中占有重要的地位。現(xiàn)階段用于地中海貧血和異常血紅蛋白輔助診斷的臨床表型研究指標(biāo)有平均紅細(xì)胞體積(MCV),平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH),異常的IbA2、HbF含量以及異常血紅蛋白的檢出。盡管如此,由于表型與基因關(guān)系的復(fù)雜性加大了研究的困難,因此聯(lián)合各種表型檢查技術(shù)輔助診斷地貧是很有必要的。為了更好的理解地貧,揭示α/非α鏈不平衡的程度,確定未知異常血紅蛋白和監(jiān)測動物實驗以及相關(guān)珠蛋白基因療法的血液學(xué)研究,珠蛋白鏈的成份分析和結(jié)構(gòu)鑒定研究就尤為重要。迄今為止,已報道有多種方法用于珠蛋白肽鏈分析,包括酶聯(lián)免疫法測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA),凝膠電泳,高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)和反相高效液相色譜法(Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC)。但是這些方法仍然面臨操作繁瑣,樣品制備耗時和分辨率有限等缺點。最近,毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis, CE)技術(shù)因其高效率,低樣品消耗,分析時間短,溶劑消耗少和分離能力高等優(yōu)勢正在成為人類珠蛋白鏈分離有吸引力的工具之一。在毛細(xì)管應(yīng)用研究中一些研究人員主要集中于探討涂層毛細(xì)管在珠蛋白鏈的分離和定量中的應(yīng)用。然而,商業(yè)性涂層毛細(xì)管因其昂貴的費用,使用的有限性以及復(fù)雜費時的處理過程限制了它在臨床實驗室的應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)在酸性條件下使用未涂層毛細(xì)管,以動態(tài)涂層替代永久性涂層同樣可以獲得良好的分離效果。盡管目前出現(xiàn)了基于該法的分析條件,卻并沒有得到廣泛的應(yīng)用。在實際應(yīng)用中,我們?nèi)悦媾R許多問題,例如：如何簡化復(fù)雜的處理過程；如何提高實驗效率獲得高的分辨率等。毛細(xì)管分離性能的提高和條件的優(yōu)化可能是兩個主要的思考方向。另外一個需要面臨的問題是,目前所報道的相關(guān)文獻中的方法條件均有所不同,找到其中的共同規(guī)律對于有此類需求的工作而言顯然具有重要意義。本研究的主要目的是基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)建立一種快速珠蛋白肽鏈分離方法,并探討該法在提示異常血紅蛋白病的臨床應(yīng)用價值,同時為相關(guān)工作提供有益的經(jīng)驗。材料與方法1.樣本收集：在本研究中,選取20例樣本(每種類型地貧各4例)用于前期分離方法的建立和實驗條件優(yōu)化。另選4個樣品(正常的成人,正常新生兒,Hb H病,中重型β-地貧)分別平行測定5次用來評估該實驗的重復(fù)性。另外,共收集了310例臨床樣本,其中正常樣本58例,α-靜止型和標(biāo)準(zhǔn)型共107例,Hb H病39例,β-地貧攜帶者43例,中重型β-地貧63例。樣本首先進行血液學(xué)表型分析初篩：血常規(guī)(重要指標(biāo)：MCV、MCH),血紅蛋白篩查(異常血紅蛋白HbE、Hb H等的檢出,HbA2)；在血液學(xué)指導(dǎo)下進行分子診斷,常見α-地貧缺失突變選用多重Gap-PCR技術(shù)進行檢測、常見α-地貧和β-地貧點突變選用反向點雜交(Reverse Dot Blot, RDB)技術(shù)進行檢測。2.毛細(xì)管區(qū)帶電泳(Capillary Zone Electrophoresis, CZE)方法的建立：總結(jié)相關(guān)參考文獻,采用國產(chǎn)未涂層石英毛細(xì)管(70 cm×50 μm),電泳緩沖液為100 mM磷酸二氫鈉水溶液,工作溫度25℃,檢測波長214nnm。首先用正常成人、正常新生兒、Hb H病以及中重型β-地中海貧患者血液樣本作方法建立、初步進行珠蛋白肽鏈分離以及條件優(yōu)化。采用以下方式預(yù)處理進樣樣品：25μl抗凝血經(jīng)0.9%生理鹽水洗滌3次后,溶于lml去離子超純水,低速離心后取上清。參考相關(guān)文獻,選擇pH3進行篩選并優(yōu)化電泳條件；觀察不同分離電壓、pH、溫度以及波長對電泳分離行為的影響并進行重復(fù)性評價。3.應(yīng)用研究：對58例正常成人樣本,107例α-地貧靜止型/標(biāo)準(zhǔn)型,39例Hb H病,43例β-地貧攜帶者,63例β-地貧中重型通過該方法檢測后進行統(tǒng)計分析�；谡＝M與各病例組統(tǒng)計比較結(jié)果(SPSS13.0),用受試者工作特征曲線(ROC)分析α/β對于β-地貧攜帶者、Hb H病的篩查效率,經(jīng)比較優(yōu)選最佳截斷值；通過使用雙變量相關(guān)分析計算斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)來確定β-地貧中重型樣品中γ/α面積比和HbF的水平之間的關(guān)聯(lián)程度。另外用所建立方法分析常見異常血紅蛋白。結(jié)果與討論經(jīng)篩選得到最優(yōu)電泳條件如下：25μl的全血用生理鹽水洗滌3次除去血漿。洗滌后的紅細(xì)胞用1ml去離子水作溶血處理。溶血產(chǎn)物4000 r/min離心10分鐘,去除細(xì)胞碎片后壓力進樣(3秒)。采用國產(chǎn)未涂層石英毛細(xì)管70 cm(總長)×50um(內(nèi)徑),分離電壓19 KV,UV檢測,設(shè)置檢測波長214nm；電泳緩沖液采用磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L磷酸二氫納,三氟乙酸調(diào)節(jié)pH至2.14),0.25%PEG-6000作動態(tài)涂層。在此電泳條件下,pre-β,β,α,γy在17min內(nèi)被很好分離。同一樣品連續(xù)五次進樣,各成分保留時間變異系數(shù)(CV)為0.37-1.69%,峰面積CV為0.46-6.71%,證實此法的穩(wěn)定性較好。降低pH可使電泳出峰峰圖更尖銳,分辨率增高,然而對珠蛋白肽鏈保留時間的影響則并不顯著。低pH環(huán)境(3)主要可減少石英管壁對蛋白質(zhì)的吸附。同時極端pH環(huán)境以及高濃度磷酸緩沖液直接使血紅蛋白四聚體解聚離解鏈成α-和β-珠蛋白鏈并保持單鏈狀態(tài)。在儀器有效范圍內(nèi),增大分離電壓可有效提升分離速度,使峰型更加尖銳,分辨率增高,但是相應(yīng)的兩成分之間的有效分離距離將會縮小,產(chǎn)生部分重疊。溫度亦是可影響分離行為的重要因素之一,實驗表明升高溫度可以減少肽鏈遷移時間,然而在高溫環(huán)境下異常峰的出現(xiàn)會干擾肽鏈的分析,且分離基線隨著溫度升高變得不穩(wěn)定。以上結(jié)果提示在儀器有效范圍內(nèi)可通過增大分離電壓或升高溫度來提高分析效率,但增大分離電壓可使分辨率下降,升高分離溫度可使分離基線不穩(wěn)定,因此,在實際工作中需根據(jù)實驗?zāi)康膶ο嚓P(guān)參數(shù)進行調(diào)整。統(tǒng)計比較結(jié)果提示,α/β在正常與其他各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。但正常組與α-地貧靜止型/標(biāo)準(zhǔn)型組、β-地貧攜帶者組均值差異不大,可能是因為正常珠蛋白鏈表達補償性增高或多余的肽鏈的降解而導(dǎo)致。基于前項分析結(jié)果,我們采用ROC曲線分析α/β比值對于提示Hb H病、中重型β-地貧診斷有重要意義,前者敏感性為100%,特異性為97.4%,后者特異性敏感性均達100%。通過對52例p-地貧中重型病人HbF值與γ/α面積比值做分析,顯示兩者之間有較高相關(guān)性(R2=0.8318,P0.01),進一步提示了毛細(xì)管區(qū)帶電泳對珠蛋白肽鏈分析方法的可行性。另外,7例Hb WS和2例Hb G-Honolulu均被準(zhǔn)確篩查出,但同樣常見于中國人群的Hb CS和Hb QS用本法卻未能檢測出,可能是因為Hb CS和Hb QS不穩(wěn)定容易降解所致或是本法的敏感性不足以檢測出這兩種異常血紅蛋白。結(jié)論α-,β-和γ-鏈的分離以及異常血紅蛋白的檢出表明本方法適合于地貧和異常血紅蛋白的臨床診斷,地貧治療評價以及其他相關(guān)研究。同時α/β面積比的ROC分析對提示中重型p-地貧、Hb H病有較高的敏感性和特異性。此外,本研究所建立方法研究策略以及各相關(guān)參數(shù)優(yōu)化的工作經(jīng)驗總結(jié)對類似工作具有一定的參考價值。
【關(guān)鍵詞】：毛細(xì)管區(qū)帶電泳 珠蛋白肽鏈 地中海貧血 異常血紅蛋白
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R394
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-20
• 第1章 引言20-32
• 1.1 血紅蛋白四聚體結(jié)構(gòu)20
• 1.2 珠蛋白基因定位以及不同發(fā)育時期的血紅蛋白組成20-21
• 1.3 地貧與異常血紅蛋白21-22
• 1.4 珠蛋白肽鏈分析概述22-32
• 第2章 實驗材料32-39
• 2.1 儀器及分析軟件32-33
• 2.2 試劑33-39
• 第3章 實驗方法39-55
• 3.1 樣本收集39
• 3.2 技術(shù)路線圖39-40
• 3.3 血液學(xué)表型分析40
• 3.4 珠蛋白肽鏈聚酸性尿素丙烯酰胺凝膠電泳40-41
• 3.5 外周血基因組DNA的提取(酚/氯仿法)41-42
• 3.6 α-貧突變檢測42-49
• 3.7 珠蛋白肽鏈分析49-55
• 第4章 實驗結(jié)果55-70
• 4.1 α、β、γ-蛋白鏈的初步分離55-56
• 4.2 相關(guān)參數(shù)對珠蛋白肽鏈分離行為的影響56-64
• 4.3 珠蛋白鏈的分離圖譜64-65
• 4.4 所建方法重復(fù)性評價65-66
• 4.5 不同臨床分類的多重比較結(jié)果66-67
• 4.6 ROC曲線分析用于提示地貧患者結(jié)果67-68
• 4.7 CZE檢測異常血紅蛋白結(jié)果68-70
• 第5章 分析與討論70-73
• 參考文獻73-78
• 攻讀期間所發(fā)表論文78-79
• 致謝79-81
• 英文縮略詞表81-83

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 趙亮;馬凌云;;酪蛋白肽延緩衰老的動物試驗研究[J];食品工業(yè);2010年05期

2 周小棉,廖云星,陳順金,錢新華,劉建武,張蒙恩;毛細(xì)管電泳法分析珠蛋白肽鏈[J];中華血液學(xué)雜志;1998年10期

3 吳偉偉;于偉;江國永;成國祥;;高效液相色譜法測定珠蛋白肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制活性[J];飼料與畜牧;2012年01期

4 劉昭明;黃翠姬;孟陸麗;黃娟娟;周文武;;核桃蛋白肽的抗氧化活性研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2009年01期

5 遲玉杰;李冰;程緣;;蛋清蛋白肽體外抗氧化作用模式的研究[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報;2013年05期

6 張延英;吳建軍;王鵬善;薛娜;舒暢;吳紅彥;;貞芪酪蛋白肽復(fù)合物血清對人肺腺癌A549細(xì)胞分化抑制作用及相關(guān)機制研究[J];中國實驗方劑學(xué)雜志;2010年04期

7 吳梧桐;孫承琦;李繼珩;鄒振偉;;抗炎蛋白肽的分離和性質(zhì)[J];臟器生化制藥;1980年01期

8 吳建軍;金玉;張延英;劉潤;李海龍;吳紅彥;李應(yīng)東;劉凱;;貞芪酪蛋白肽復(fù)合物對Lewis肺癌荷瘤小鼠抗瘤作用及對IL-2、TNF的影響[J];中成藥;2012年12期

9 陳忠敏;朱強松;陳漢;郝雪菲;羅琴;;再生絲素蛋白肽/聚乙烯醇膜材料性能的實驗研究[J];材料導(dǎo)報;2012年06期

10 張?zhí)m娥;李清華;康白;梁曉琴;;地龍蛋白肽的成分分析及對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活力的影響[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2013年12期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 王君虹;周利亙;陳新峰;袁亞;;固定化木瓜蛋白酶水解制備乳酪蛋白肽[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

2 周利亙;郜海燕;陳新峰;王春輝;王君虹;陳堅;袁亞;謝磊;;乳源酪蛋白肽脫色工藝條件的研究[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

3 邱芳萍;趙立冬;解聳林;劉紅霞;;鵝血血紅蛋白肽工藝的研究[A];中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第五屆年會暨第四屆東西方食品業(yè)高層論壇論文摘要集[C];2007年

4 萬均輝;田佩玲;熊符;周萬軍;韋相才;徐湘民;;反相高效液相色譜快速分離珠蛋白肽鏈及其應(yīng)用研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國計劃生育學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2012年

5 張清麗;徐皎云;吳佳娜;趙謀明;;一種促進乳酸菌生長的酪蛋白肽的分離純化和鑒定[A];2010年中國農(nóng)業(yè)工程學(xué)會農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程分會學(xué)術(shù)年會暨華南地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)學(xué)研研討會論文摘要集[C];2010年

6 蘇鵬;賴永榕;劉容容;;siRNA對K562細(xì)胞α珠蛋白肽鏈mRNA表達及細(xì)胞增殖的影響[A];第十一屆全國紅細(xì)胞疾病學(xué)術(shù)會議暨學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2007年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 向杰;我國魚蛋白肽生產(chǎn)實現(xiàn)無害化[N];科技日報;2006年

2 ;波諾特蛋白肽批量投產(chǎn)[N];四川日報;2003年

3 洋洋;以動物蛋白質(zhì)為主的蛋白肽面世[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

4 汪依凡;又一項國家海洋創(chuàng)新成果獲推廣[N];中國海洋報;2006年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 任國譜;高蛋白肽奶粉的研制[D];華東師范大學(xué);2005年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張全才;米蛋白肽鋅的制備工藝及產(chǎn)品特性研究[D];南昌大學(xué);2007年

2 陳升軍;米蛋白肽及米蛋白肽鐵螯合物生產(chǎn)工藝研究[D];南昌大學(xué);2008年

3 童靜靜;東海烏參蛋白肽的酶法制取及精制研究[D];浙江大學(xué);2014年

4 李庭;米蛋白肽鋅的制備工藝及中試研究[D];南昌大學(xué);2008年

5 谷中華;面筋蛋白肽的制備及其對小鼠功能特性的影響[D];江南大學(xué);2014年

6 薛文杰;蛋白肽對土壤微生態(tài)和植物生長的調(diào)控效應(yīng)研究[D];湖北大學(xué);2014年

7 范露;魚蛋白肽螯合鈣的制備及特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

8 張波;蛋白肽對含銅尾礦砂的微生態(tài)調(diào)控效應(yīng)研究[D];湖北大學(xué);2014年

9 崔竹梅;鷹嘴豆蛋白的制備與其蛋白肽功能性質(zhì)的研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

10 林麗;毛細(xì)管區(qū)帶電泳法快速分離珠蛋白肽鏈及其應(yīng)用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：毛細(xì)管區(qū)帶電泳法快速分離珠蛋白肽鏈及其應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：288402