本文關(guān)鍵詞：基于斑馬魚疾病模型研究ADAR1基因的功能，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:基于斑馬魚模型探討ADAR1基因?qū)z傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symmetrica hereditaria,DSH)的影響,以及DSH患者皮損色素沉著區(qū)和色素減退區(qū)是否存在細(xì)胞凋亡,是否存在C-kit表達(dá)差異,旨在研究DSH發(fā)病機(jī)制以對其預(yù)防和治療提供幫助。方法:(1)收集一DSH家系,并對其進(jìn)行ADAR1基因測序檢測致病突變(2)利用morpholino技術(shù)下調(diào)斑馬魚adar1基因表達(dá),并在斑馬魚48hpf及72hpf兩個時間點(diǎn)觀察引起的特異性表型。(3)在48hpf及72hpf兩個時間點(diǎn)觀察各組斑馬魚尾部黑素含量。(4)各組分別收集50個樣本并利用RT-PCR評估斑馬魚胚胎發(fā)育后8、16、28、32、36、52、64和76小時adar1基因表達(dá),以證實adar1基因下調(diào)成功。(5)利用RT-PCR來探討胚胎發(fā)育后48小時及72小時各組間wnt11、c-kit、mitf、rhoa及cdc42基因表達(dá)的差異。(6)收集DSH患者皮損標(biāo)本并利用免疫組化技術(shù)探討色素加深區(qū)和色素減退區(qū)C-kit表達(dá)的差異。(7)運(yùn)用Tunel實驗技術(shù)探討DSH患者皮損色素加深區(qū)和色素減退區(qū)細(xì)胞的凋亡情況結(jié)果:(1)在DSH家系患者中發(fā)現(xiàn)ADAR1基因的2號外顯子處存在移碼突變c.1019_1020del AG(p.Gln340Argfs*5)(2)DSH斑馬魚模型成功下調(diào)adar1基因的表達(dá)。(3)72小時adar1下調(diào)組斑馬魚尾部黑色素含量明顯高于空白對照組和單加嗎啡琳組。(4)adar1下調(diào)組中的斑馬魚在48hpf和72hpf黑素細(xì)胞細(xì)胞極性發(fā)生改變,而在72hpf出現(xiàn)黑素細(xì)胞遷移和分布異常。(5)下調(diào)斑馬魚adar1基因的表達(dá)導(dǎo)致胚胎48hpf rhoa和cdc42的下調(diào),72hpf wnt11的下調(diào),48hpf及72hpf mitf、c-kit的下調(diào)。(6)C-kit表達(dá)在DSH患者皮損色素沉著區(qū)明顯高于色素減退區(qū)。(7)更多的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生在DSH患者皮損色素減退區(qū)。結(jié)論:基因測序分析在DSH家系中發(fā)現(xiàn)c.1019_1020del AG(p.Gln340Argfs*5)致病突變,為首次報道。斑馬魚疾病模型提示adar1基因下調(diào)后影響了黑素細(xì)胞的細(xì)胞極性和遷移,并且影響黑素母細(xì)胞的發(fā)育,人體組織標(biāo)本則顯示C-kit受體在色素沉著區(qū)表達(dá)明顯強(qiáng)于色素減退區(qū),更多的凋亡在色素減退區(qū)出現(xiàn),提示色素減退區(qū)黑素細(xì)胞的過度凋亡和C-kit受體對DSH患者色素異常的發(fā)生可能起到一定的作用。
【關(guān)鍵詞】：遺傳性對稱性色素異常癥 斑馬魚模型 色素 C-kit受體
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R-332;R758.5
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文縮略語表11-14
• 第一部分 緒論14-17
• 第二部分 材料與方法17-29
• 2.1 研究對象17-18
• 2.1.1 DSH家系17-18
• 2.1.2 用于模型構(gòu)建的斑馬魚采集18
• 2.2 標(biāo)本收集18-19
• 2.3 實驗材料19
• 2.4 主要試劑配制19-20
• 2.5 主要儀器和耗材20-21
• 2.6 研究方法21-29
• 2.6.1 患者外周血基因組DNA提取21
• 2.6.2 PCR擴(kuò)增21-22
• 2.6.3 PCR產(chǎn)物質(zhì)量評估和純化22
• 2.6.4 測序和結(jié)果分析22
• 2.6.5 ADAR1 Morpholino設(shè)計22-23
• 2.6.6 MO顯微注射條件23
• 2.6.7 確定MO顯微注射劑量23
• 2.6.8 MO有效性的驗證23-24
• 2.6.9 表型觀察及分析24
• 2.6.10 斑馬魚組織總RNA提取24-25
• 2.6.11 RT-PCR步驟方法25-27
• 2.6.12 DSH患者皮損組織免疫組化27
• 2.6.13 DSH患者皮損組織TUNEL染色27-29
• 第三部分 結(jié)果29-42
• 3.1 DSH患者基因測序結(jié)果29-30
• 3.2 斑馬魚模型建立30-36
• 3.3 DSH斑馬魚模型各組C-kit、Mitf、Rhoa、Cdc42、Wnt11 mRNA水平檢測36-39
• 3.4 DSH患者C-kit受體于皮損色素沉著和色素減退區(qū)免疫組化結(jié)果39-41
• 3.5 DSH患者于皮損色素沉著和色素減退區(qū)細(xì)胞凋亡情況41-42
• 第四部分 討論42-46
• 第五部分 結(jié)論46-47
• 第六部分 參考文獻(xiàn)47-50
• 在讀期間發(fā)表的論文50-51
• 致謝51

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：284244