發(fā)布時(shí)間：2017-04-03 06:12

  本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)常引起皮膚和軟組織感染。由于其菌株耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重,使抗菌藥物治療無(wú)濟(jì)于事,疫苗免疫接種便成為預(yù)防S.aureus感染的最佳選擇。但由于S.aureus致病因子眾多,且過(guò)去的疫苗傾向于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答,因而免疫保護(hù)效果均不理想。已經(jīng)證明,CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答特別是Th1和Th17在預(yù)防S.aureus感染過(guò)程中發(fā)揮主要作用。因而,有必要研究S.aureus抗原啟動(dòng)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的多表位疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)作用。本研究對(duì)S.aureus IsdB蛋白的CD4+T細(xì)胞表位進(jìn)行篩選,并將其與TraP蛋白的CD4+T細(xì)胞表位、TraP和FnBPA蛋白的線性B細(xì)胞表位串聯(lián),構(gòu)建重組多表位疫苗,并研究其免疫原性和免疫保護(hù)作用。首先對(duì)S.aureus IsdB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其與MHC結(jié)合能力進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,篩選合成6個(gè)可能的候選表位。將IsdB和候選表位分別與弗氏佐劑乳化后接種BALB/c和C57BL/6小鼠,檢測(cè)候選表位刺激脾臟CD4+T細(xì)胞增殖及其分泌的細(xì)胞因子水平。結(jié)果,候選表位P4(287-306aa)和P1(159-178aa)可分別促進(jìn)BALB/c和C57BL/6小鼠CD4+T細(xì)胞增殖并分泌高水平IFN-γ及IL-17A,與PBS組比差異極顯著,而IL-4和IL-10的水平幾乎保持不變。表明P4和P1主要引起Th1/Th17型免疫反應(yīng),分別屬于H-2d和H-2b型CD4+T細(xì)胞表位,且高度保守。在該研究基礎(chǔ)上,將鑒定的2個(gè)IsdB蛋白CD4+T細(xì)胞表位(P1和P4)與已獲得的2個(gè)TraP的CD4+T細(xì)胞表位(TraP20-39和TraP94-113)、1個(gè)TraP的線性B細(xì)胞表位(TraP154-163)和2個(gè)FnbpA的線性B細(xì)胞表位(FnbpA352-364和FnbpA763-772)串聯(lián)表達(dá),構(gòu)建成為重組表位疫苗并命名為ITF。將純化后的ITF與弗氏佐劑乳化,以腿部肌肉注射免疫接種BALB/c和C57BL/6小鼠,檢測(cè)ITF誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答水平。結(jié)果,兩種小鼠免疫ITF后均可產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。S.aureus Newman株攻擊后,在對(duì)照組存活率分別為10%和20%時(shí),ITF誘導(dǎo)BALB/c和C57BL/6小鼠產(chǎn)生的免疫保護(hù)率分別為60%和70%。上述結(jié)果表明,重組表位疫苗ITF可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效防御S.aureus感染的作用,為新型S.aureus疫苗研究提供參考。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 鐵離子表面決定簇B RNAⅢ激活蛋白的靶蛋白 纖連蛋白結(jié)合蛋白A T細(xì)胞表位 B細(xì)胞表位 多表位疫苗
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符號(hào)說(shuō)明10-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-21
• 1.1 引言11
• 1.2 S. aureus疫苗研究進(jìn)展11-12
• 1.3 表位疫苗研究進(jìn)展12-14
• 1.3.1 表位篩選及鑒定12-13
• 1.3.2 表位疫苗的構(gòu)建及應(yīng)用13-14
• 1.4 S. aureus致病因子14-18
• 1.4.1 S. aureus FnBPA蛋白研究進(jìn)展15-16
• 1.4.2 S. aureus IsdB蛋白研究進(jìn)展16-17
• 1.4.3 S. aureus TraP蛋白研究進(jìn)展17-18
• 1.5 本研究的目的及意義18-21
• 第二章 S. aureus IsdB蛋白CD4~+ T細(xì)胞表位分析21-37
• 2.1 材料21
• 2.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21
• 2.1.2 主要試驗(yàn)試劑21
• 2.1.3 試劑盒及其他21
• 2.2 方法21-26
• 2.2.1 S. aureus IsdB的CD4~+ T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)21-22
• 2.2.2 蛋白純化及多肽合成22
• 2.2.3 小鼠免疫22-23
• 2.2.4 抗原提呈細(xì)胞制備23
• 2.2.5 分選CD4~+ T細(xì)胞23-24
• 2.2.6 CD4~+ T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)24
• 2.2.7 細(xì)胞因子檢測(cè)24-25
• 2.2.8 表位保守性分析25-26
• 2.2.9 統(tǒng)計(jì)分析26
• 2.3 結(jié)果26-34
• 2.3.0 IsdB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化26
• 2.3.1 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果26-27
• 2.3.2 S. aureus IsdB的CD4~+ T細(xì)胞抗原表位在線預(yù)測(cè)結(jié)果27-29
• 2.3.3 多肽體外刺激CD4~+ T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果29-32
• 2.3.4 多肽體內(nèi)刺激CD4~+ T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果32
• 2.3.5 抗原表位保守性分析32-34
• 2.4 討論34-37
• 第三章 金黃色葡萄球菌IsdB、TraP和FnBPA蛋白多表位疫苗的免疫原性研究37-53
• 3.1 材料37
• 3.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物37
• 3.1.2 主要試驗(yàn)試劑37
• 3.1.3 試劑盒及其他37
• 3.2 方法37-44
• 3.2.1 重組基因ITF- pUC57構(gòu)建37-39
• 3.2.2 重組表位原核表達(dá)載體ITF-pET32a構(gòu)建39-40
• 3.2.3 重組表位原核表達(dá)載體ITF-pET32a構(gòu)建及鑒定40
• 3.2.4 重組表位的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot檢測(cè)40-41
• 3.2.5 動(dòng)物免疫及攻毒實(shí)驗(yàn)41
• 3.2.6 分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞41-42
• 3.2.7 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)42
• 3.2.8 細(xì)胞因子檢測(cè)42
• 3.2.9 血清抗體亞類檢測(cè)42-43
• 3.2.10 調(diào)理吞噬試驗(yàn)43-44
• 3.2.11 統(tǒng)計(jì)分析44
• 3.3 結(jié)果44-50
• 3.3.1 重組表位疫苗ITF構(gòu)建結(jié)果44
• 3.3.2 重組ITF誘導(dǎo)特異性血清抗體亞類44-45
• 3.3.3 重組ITF誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞因子45-46
• 3.3.4 重組ITF誘導(dǎo)的特異性淋巴細(xì)胞增殖46-48
• 3.3.5 調(diào)理吞噬結(jié)果48-49
• 3.3.6 重組ITF誘導(dǎo)小鼠的免疫保護(hù)作用49-50
• 3.4 討論50-53
• 第四章 全文結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-63
• 致謝63-65
• 附錄 165-69
• 附錄 269-71
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷71

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本文編號(hào)：283848