本文關(guān)鍵詞：蛇毒蛋白Triflin PR-1結(jié)構(gòu)域TFPR1的免疫增強作用及作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：疫苗接種是防治傳染性疾病的有效途徑。近年來,更安全、有效的新型疫苗的研發(fā)日益受到重視。新型疫苗包括亞單位疫苗、合成肽疫苗、基因工程疫苗等,其分子小、免疫原性相對較差,難以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,需要佐劑來增強其免疫原性或宿主對抗原的保護性應(yīng)答。目前美國FDA批準(zhǔn)的廣泛用于人群疫苗的鋁鹽佐劑誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫較弱,對于某些新型疫苗佐劑活性較差,尤其是對于分子量小的多肽抗原無佐劑活性,不能完全滿足新型疫苗發(fā)展的需要。發(fā)現(xiàn)和研發(fā)更安全有效的新型免疫調(diào)節(jié)劑對疫苗的發(fā)展具有十分重要的意義。Triflin是一種蛇毒CRISPs蛋白,其N端PR-1結(jié)構(gòu)域與植物中具有抵抗病原感染的PR-1蛋白在空間結(jié)構(gòu)上具有高度同源性,推測可能與免疫調(diào)節(jié)作用相關(guān)。本研究針對Triflin的PR-1結(jié)構(gòu)域,系統(tǒng)進(jìn)行了PR-1結(jié)構(gòu)域的重組表達(dá)、免疫增效作用及作用機制研究。研究目的本研究探索Triflin蛋白PR-1結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)的重組蛋白TFPR1的佐劑活性及其免疫調(diào)節(jié)機制,不但可闡明PR-1結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能,同時可獲得一種新型佐劑,為新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ),也為新型佐劑的發(fā)現(xiàn)、設(shè)計及研發(fā)提供新思路。研究方法(1) Triflin蛋白結(jié)構(gòu)分析及重組蛋白TFPR1的制備通過對Triflin蛋白序列N端進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析和同源建模預(yù)測,確定以該蛋白PR-1結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)的重組蛋白TFPR1的對應(yīng)基因序列；根據(jù)大腸桿菌密碼子嗜性優(yōu)化后進(jìn)行人工合成并采用原核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白TFPR1經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定,并分析其表達(dá)形式；利用鎳柱親和層析法純化包涵體蛋白,采用透析法進(jìn)行蛋白復(fù)性；分別利用SDS-PAGE檢測蛋白純度、Bradford法測定蛋白濃度以及鱟試劑凝膠法測定蛋白內(nèi)毒素含量；分析重組蛋白TFPR1的穩(wěn)定性,并以復(fù)性后TFP R1免疫BALB/c雌性小鼠,分析其在小鼠體內(nèi)的生物活性。(2)重組蛋白TFPR1對蛋白和多肽抗原的免疫增強作用研究分別以經(jīng)典模式抗原OVA、重組蛋白類抗原HBsAg及小分子肽類抗原HIV-1 Pep5作為模式抗原,依照一定比例簡單混合后肌肉注射途徑免疫BALB/c雌性小鼠,以人用鋁鹽佐劑為對照,ELISA法和ELISPOT法分別檢測小鼠對抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答情況,分析重組蛋白TFPR1的免疫增效特點；在TFPR1自身抗體存在的情況下,分析預(yù)存抗體對TFPR1佐劑活性的影響。(3)重組蛋白TFPR1增強抗原免疫應(yīng)答的作用機制研究以人PBMCs為對象,開展重組蛋白TFPR1體外結(jié)合及刺激實驗。利用流式細(xì)胞技術(shù)分析TFPR1結(jié)合的免疫細(xì)胞類別；利用ELISA法檢測細(xì)胞樣本在蛋白刺激后產(chǎn)生的不同細(xì)胞因子水平；進(jìn)一步利用toll樣受體的抗體封閉實驗、NF-κB通路阻斷實驗探索TFPRl蛋白參與免疫調(diào)節(jié)的具體通路及機制。研究結(jié)果(1)成功設(shè)計并表達(dá)了具有生物活性的重組蛋白TFPR1。重組蛋白TFPR1為Triflin蛋白的生物信息學(xué)分析設(shè)計,具有PR-1結(jié)構(gòu)域的經(jīng)典結(jié)構(gòu),即α-β-α的三明治結(jié)構(gòu)；TFPR1在大腸桿菌中主要以包涵體形式表達(dá),經(jīng)純化復(fù)性后獲得純度95%以上的重組蛋白,復(fù)性后的TFPR1主要以單體形式存在,其次為二聚體；在未添加任何穩(wěn)定劑和防腐劑的條件下,重組蛋白TFPR1在磷酸鹽緩沖液中常溫保存三個月仍有75%的蛋白保持穩(wěn)定,說明該蛋白具有良好的穩(wěn)定性；經(jīng)內(nèi)毒素去除,重組蛋白TFPR1的內(nèi)毒素含量低于0.25 U;重組蛋白TFPR1肌肉途徑免疫小鼠無需任何佐劑即可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高的抗TFPR1的抗體,表明TFPR1具有自身佐劑活性。(2)重組蛋白TFPR1可顯著增強蛋白類和多肽類抗原的免疫原性,同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫以不同模式抗原探究重組蛋白TFPR1的佐劑活性,研究表明TFPR1具有佐劑活性,與蛋白、多肽類抗原簡單混合后,可引起較強的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,具有Thl型偏倚的免疫應(yīng)答,佐劑活性優(yōu)于鋁鹽佐劑；重組蛋白TFPR1具有良好的安全性,不會引起免疫小鼠的不良反應(yīng)；同時,在抗TFPR1抗體存在的條件下并不影響其佐劑活性。(3)重組蛋白TFPR1可能通過結(jié)合TLR4繼而激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生Thl型和調(diào)節(jié)型細(xì)胞因子采用現(xiàn)代分子生物學(xué)及免疫學(xué)實驗,從細(xì)胞和分子水平對TFPR1的免疫增效機制進(jìn)行研究。實驗表明,重組蛋白TFPR1可結(jié)合不同類型的免疫細(xì)胞,刺激人PBMCs產(chǎn)生INF-γ、TNF-α及IL-10等不同類型的細(xì)胞因子；這種激活作用是劑量依賴的。繼而發(fā)現(xiàn),應(yīng)用具有中和作用的抗人TLR4多克隆抗體封閉PBMCs后,再加入TFP R1刺激,其上清中的IFN-γ顯著下降；最后,以TFPR1蛋白刺激穩(wěn)定表達(dá)TLR4的293T細(xì)胞系,其IL-8顯著升高,而陰性對照組則無IL-8產(chǎn)生,這進(jìn)一步證明TFPR1免疫調(diào)節(jié)作用可能通過激活TLR4發(fā)揮作用。結(jié)論本研究構(gòu)建并成功表達(dá)triflin蛋白的活性功能區(qū)TFPR1,并發(fā)現(xiàn)TFPR1蛋白具有良好的免疫增效作用。TFPR1只需與抗原簡單混合,無需偶聯(lián),不但可以增強蛋白抗原(卵白蛋白和重組乙肝表面抗原)的免疫原性,誘導(dǎo)Thl偏倚的Th1/Th2體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答；更為重要的是,TFPR1可以顯著增強多肽抗原的免疫原性。重組蛋白TFP R1可能通過TLR4進(jìn)而激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生Thl型和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子發(fā)揮免疫增強作用。本研究發(fā)現(xiàn)了一種具有良好免疫增效作用的免疫調(diào)節(jié)分子。這不但對疫苗研發(fā)具有重要意義,同時也揭示了PR-1結(jié)構(gòu)域的免疫調(diào)節(jié)功能,為新型免疫調(diào)節(jié)劑的發(fā)現(xiàn)提供了思路。
【關(guān)鍵詞】：佐劑 PR-1結(jié)構(gòu)域 Toll樣受體 免疫調(diào)節(jié)
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 前言16-19
• 第一部分 重組蛋白TFPR1的表達(dá)與鑒定19-35
• 引言19-20
• 1 材料與方法20-25
• 1.1 菌株與質(zhì)粒20
• 1.2 試劑20
• 1.3 實驗動物20
• 1.4 主要儀器20-21
• 1.5 Triflin空間結(jié)構(gòu)分析,預(yù)測設(shè)計TFPR121
• 1.6 重組蛋白TFPR1在原核表達(dá)系統(tǒng)中的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定21-23
• 1.7 重組蛋白TFPR1的生物學(xué)活性分析23-24
• 1.8 統(tǒng)計方法24-25
• 2 實驗結(jié)果25-32
• 2.1 基于Triflin蛋白的預(yù)測設(shè)計,獲得TFPR125-26
• 2.2 TFPR1在原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定26-30
• 2.3 TFPR1的生物學(xué)活性分析30-32
• 3 討論32-35
• 第二部分 重組蛋白TFPR1的佐劑活性分析35-48
• 引言35-36
• 1 材料與方法36-40
• 1.1 實驗動物36
• 1.2 主要試劑36
• 1.3 主要儀器與設(shè)備36-37
• 1.4 以O(shè)VA為模式抗原檢測TFPR1的佐劑活性37-38
• 1.5 以HBsAg為模式抗原檢測TFPR1的佐劑活性38-39
• 1.6 以多肽HIV-1 Pep5為模式抗原檢測TFPR1的佐劑活性39
• 1.7 預(yù)存抗TFPR1抗體對TFPR1佐劑活性的影響39
• 1.8 統(tǒng)計方法39-40
• 2 實驗結(jié)果40-45
• 2.1 TFPR1對經(jīng)典模式抗原OVA的免疫增效作用40-41
• 2.2 TFPRl增強HBsAg的免疫原性，同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫41-42
• 2.3 TFPR1可以增強多肽抗原的免疫原性，，同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫42-44
• 2.4 機體內(nèi)預(yù)存的高水平抗TFPR1不影響TFPR1的佐劑活性44-45
• 3 討論45-48
• 第三部分 重組蛋白TFPR1的免疫調(diào)節(jié)機制研究48-59
• 引言48-49
• 1 材料與方法49-53
• 1.1 實驗細(xì)胞49
• 1.2 主要試劑49
• 1.3 主要儀器與設(shè)備49-50
• 1.4 重組蛋白TFPR1對人PBMCs的體外激活與結(jié)合實驗50-51
• 1.5 重組蛋白TFPR1發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的受體研究51-52
• 1.6 重組蛋白TFPR1對NF-κB通路影響的初步研究52
• 1.7 統(tǒng)計方法52-53
• 2 實驗結(jié)果53-57
• 2.1 重組蛋白TFPR1體外可以激活并結(jié)合人PBMCs53-54
• 2.2 抗TLR4抗體顯著抑制TFPR1對人PBMCs的激活作用54-55
• 2.3 重組蛋白TFPR1可以激活穩(wěn)定表達(dá)hTLR4的細(xì)胞55-56
• 2.4 重組蛋白TFPR1免疫調(diào)節(jié)功能與NF-κB通路的相關(guān)性研究56-57
• 3 討論57-59
• 結(jié)論59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 附錄66-70
• 綜述70-81
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 致謝81-83
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄83-84
• 個人簡歷84

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：蛇毒蛋白Triflin PR-1結(jié)構(gòu)域TFPR1的免疫增強作用及作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：282591