本文關(guān)鍵詞：重組人乙酰膽堿酯酶的表達(dá)純化及其抑制劑篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)作為一種存在于膽堿能突觸間隙的由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的生物催化劑,屬于生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶。它不僅參與細(xì)胞的生長以及發(fā)育,同時對神經(jīng)的再生和神經(jīng)元的發(fā)育也有促進(jìn)作用,并對維持人體神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能占有著非常重要的地位。乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)是AChE的水解底物,ACh會受AChE的催化發(fā)生裂解反應(yīng),導(dǎo)致ACh的缺失,從而使得各神經(jīng)信號傳遞失敗。而ACh水平的降低或活性的異常則是造成阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)生的主要原因。近年來,通過提高ACh的水平來治療AD,這已經(jīng)成為目前主要的治療方式。因此,通過抑制AChE來恢復(fù)或提高ACh的水平是治療AD持續(xù)有效的方法。乙酰膽堿酯酶抑制劑(Acetylcholinesterase inhibitor,AChEI)能夠選擇性的抑制腦內(nèi)AChE的活性,使ACh在大腦內(nèi)的存留時間延長,提高AD病人的膽堿神經(jīng)功能,同時也能有效緩解病人的認(rèn)知能力障礙降低病人。迄今為止,對于輕、中度的AD治療AChEI已經(jīng)成為主流產(chǎn)品。經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市的6種AChEI,它們分別是他克林(Tararine)、加蘭他敏(Galanthamine)、利伐司替明(Rivastigmine)、石杉堿甲(Huperzine A)以及復(fù)方新藥Namzari和多奈哌齊(Donepezil,E2020),但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的AChEI還有較多缺點存在,例如半衰期短、毒性大以及較嚴(yán)重的膽堿能外周系統(tǒng)的副作用等,這使得它們在臨床應(yīng)用上面受到一定限制。因此,尋找發(fā)現(xiàn)作用時間長、副作用小的新一代AChEI仍是目前治療AD藥物的研究熱點。本研究旨在利用體外人胚腎(HEK293)細(xì)胞建立表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶(Recombinant human acetylcholinesterase,rhAChE)的表達(dá)系統(tǒng),使用pCMV-AChE質(zhì)粒對其進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染,分泌表達(dá)酶液到培養(yǎng)基,并通過對酶動力學(xué)的研究來考察重組表達(dá)蛋白的酶活性。使用DEAE-Sepharose FF親和層析對高效表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化,以獲得純度較高、活性較強的重組人乙酰膽堿酯酶,從而建立重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑的體外評價篩選模型,并應(yīng)用該模型從天然產(chǎn)物及其衍生物中篩選其中藥抑制劑和對一系列化合物的抑制活性的測定。1、HEK293細(xì)胞分泌表達(dá)重組人乙酰膽堿酯酶(rhAChE)pcmv-ache質(zhì)粒由浙江大學(xué)藥學(xué)院所贈送。測定pcmv-ache的dna序列確證ache部分與ache結(jié)構(gòu)基因序列(genbankaccessionno:nm--000665)一致。通過陽離子脂質(zhì)體lipofectaminetm2000介導(dǎo)pcmv-ache從而對hek293細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。建立此表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)的rhache至細(xì)胞培養(yǎng)液中,收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為酶液,進(jìn)行ache活性分析,最終獲得粗酶液進(jìn)行下一步純化。2、rhache活性和檢測體系研究采用改進(jìn)的ellman方法進(jìn)行酶活檢測:反應(yīng)體系中加入酶液和顯色劑dtnb(5,5,-二硫代雙-2-二硝基苯甲酸),ph7.4的pbs,在37℃培養(yǎng)箱孵育6min,加入底物碘化硫代乙酰膽堿(atch)后37℃繼續(xù)孵育16min,最后加入sds終止反應(yīng),使用酶標(biāo)儀測定在412nm下的吸光度(od值),rhache的反應(yīng)速率單位用od/min來表示。3、rhache的純化和鑒定為獲得純度更高、活性更強的rhache,對收集的細(xì)胞培養(yǎng)液即酶液進(jìn)行活性分析后,通過透析過夜,使用deae-sepharoseff親和層析柱梯度洗脫純化,收集蛋白純化液,進(jìn)行活性檢測,聚乙二醇4000進(jìn)行5倍濃縮,bca蛋白濃度試劑盒測得蛋白濃度為0.145mg/ml,純化液比活力為6.55u/mg,純化倍數(shù)為9.63,酶活回收率為56%。該酶的相對分子質(zhì)量約為64kd。以碘化硫代乙酰膽堿為底物時,酶的最適反應(yīng)溫度為37℃,最適ph為7.4,最適底物濃度為5mmol/l。進(jìn)行sds-page、native-page鑒定,在分子量64kd附近出現(xiàn)明顯的rhache的單一條帶。純化液進(jìn)行westernblot分析,一抗為anti-acheantibody抗體,在分子量64kd附近出現(xiàn)明顯rhache單一條帶。由于重組人乙酰膽堿酯酶的純度會直接決定最終檢測的準(zhǔn)確性和可靠性,本實驗對人的乙酰膽堿酯酶的分離純化及生物學(xué)方面的意義做了研究,即如何使rhache的純化效率達(dá)到最大,減少及簡化純化步驟,使酶活的損失降低,以提高純化的倍數(shù)。4、rhache抑制劑的篩選多奈哌齊對ache是可逆性的抑制劑,其在粗酶液的ic50為14.0nmol/l。本研究選擇7個濃度來測定多奈哌齊對純化液rhache的抑制率效果,以化合物摩爾濃度的負(fù)對數(shù)和酶抑制率進(jìn)行線性回歸,求取ic50值。反應(yīng)體系條件:ph7.4,酶量5μl,多奈哌齊濃度:0,5.0,10.0,20.0,40.0,80.0,160nmol/l,底物濃度:0.5mmol/l,反應(yīng)溫度37℃,反應(yīng)時間16min。結(jié)果測得純化后的rhache的ic50明顯降低為5.0nmol/l左右。利用以上建立的人乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究模型進(jìn)行rhAChE抑制活性評價和化合物的篩選,對評價后具有顯著抑制活性的有效部位進(jìn)行含量測定和結(jié)構(gòu)鑒定。同時可以更高效、快捷的對來自天然藥物中乙酰膽堿酯酶抑制劑成分作進(jìn)一步篩選、鑒定。
【關(guān)鍵詞】：乙酰膽堿酯酶 HEK293 重組人乙酰膽堿酯酶 純化 抑制劑
【學(xué)位授予單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392;Q55
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 1 前言12-19
• 1.1 阿爾茨海默病12-13
• 1.2 乙酰膽堿13-14
• 1.2.1 乙酰膽堿的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)13
• 1.2.2 乙酰膽堿缺失的危害及防治13-14
• 1.2.3 提高乙酰膽堿水平的方法14
• 1.3 乙酰膽堿酯酶（AChE）14-15
• 1.3.1 乙酰膽堿酯酶結(jié)構(gòu)特性14
• 1.3.2 乙酰膽堿酯酶的研究進(jìn)展14-15
• 1.4 重組人乙酰膽堿酯酶（rhAChE）15-17
• 1.4.1 HEK293細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)rhAChE及意義15-16
• 1.4.2 重組人乙酰膽堿酯酶的純化研究16-17
• 1.5 天然產(chǎn)物中重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選17-18
• 1.6 本研究的創(chuàng)新之處18
• 1.7 主要研究內(nèi)容18-19
• 2 重組人乙酰膽堿酯酶的表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化19-29
• 2.1 材料和試劑19-22
• 2.1.1 主要儀器與設(shè)備19-20
• 2.1.2 試劑與材料20-22
• 2.2 試驗方法22-26
• 2.2.1 表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及粗酶液的獲得22-25
• 2.2.2 酶活檢測25-26
• 2.2.3 rhAChE表達(dá)條件的優(yōu)化26
• 2.3 試驗結(jié)果26-28
• 2.3.1 rhAChE的表達(dá)系統(tǒng)建立26-27
• 2.3.2 rhAChE粗提液表達(dá)條件的優(yōu)化27-28
• 2.4 討論28-29
• 3 重組人乙酰膽堿酯酶純化29-43
• 3.1 材料和試劑29-32
• 3.1.1 儀器與設(shè)備29
• 3.1.2 試劑與材料29-32
• 3.2 試驗方法32-38
• 3.2.1 rhAChE的分離純化32
• 3.2.2 rhAChE的活性鑒定32-33
• 3.2.3 BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度33
• 3.2.4 SDS-PAGE、Native-PAGE、Western blot電泳分析重組蛋白33-37
• 3.2.5 rhAChE性質(zhì)的測定37-38
• 3.3 試驗結(jié)果38-42
• 3.3.1 rhAChE的分離純化38-39
• 3.3.2 SDS-PAGE、Native-PAGE、Western blot分析rhAChE純化液39-41
• 3.3.3 rhAChE純化液理化性質(zhì)41-42
• 3.4 討論42-43
• 4 重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選43-45
• 4.1 重組人乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型的建立43-44
• 4.1.1 材料和試劑43
• 4.1.2 試驗方法43-44
• 4.1.3 試驗結(jié)果44
• 4.2 討論44-45
• 5 結(jié)論與展望45-47
• 5.1 結(jié)論45
• 5.2 展望45-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 英文縮略詞表53-54
• 個人簡介54-55
• 致謝55

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔣芝華,江連海,沈鍔;LOCALIZATION OF THE SUPERIOR SALIVATORY NUCLEUS OF RAT——A STUDY USING COMBINATION OF AChE AND HRP HISTOCHEMICAL TECHNIQUES[J];Science Bulletin;1985年11期

2 王書榮,王蔭亭,王炫q

本文編號：282501