本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用MDCK細胞表達流感減毒活疫苗（LAIV）和應(yīng)用雞胚檢測病毒滴度方法學驗證的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究采用Cytodex3微載體,以MDCK細胞作為流感病毒生產(chǎn)基質(zhì),探索了H1N1(A/17/California/2009/38)型流感病毒以及B (B/56/Brisbane/60/08)型流感病毒最適增殖條件。采用正交設(shè)計的方法,考察TPCK胰酶濃度、病毒培養(yǎng)液pH以及病毒感染復(fù)數(shù)MOI對Cytodex3微載體上MDCK細胞生長的流感病毒滴度的影響。通過以上研究,確定了TPCK胰酶終濃度為1.0μg/ml,病毒培養(yǎng)液pH7.2,病毒感染復(fù)數(shù)MOI為0.1作為流感病毒最佳培養(yǎng)參數(shù)。為了考察生物反應(yīng)器表達流感病毒的重復(fù)性,采用上述培養(yǎng)參數(shù)行了兩次實驗,HIN1及B型流感減毒株均在接種后72小時達到病毒滴度峰值,到達峰值時,HIN1及B型流感病毒滴度均值可分別達到7.6±0.151gEID50及7.1±0.261gEID50,并且此濃度TPCK-胰酶對MDCK細胞無明顯損傷。市售流感疫苗主要以雞胚為基質(zhì)生產(chǎn),但是雞胚中存在的卵清蛋白可能引起過敏反應(yīng),病毒在雞胚連續(xù)傳代后,病毒容易發(fā)生變異,使其不能與人群中的流行毒株完全匹配。為此世界衛(wèi)生組織鼓勵生產(chǎn)廠家開發(fā)以哺乳動物細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的流感疫苗。本實驗以MDCK細胞為生產(chǎn)基質(zhì),選擇微載體培養(yǎng)方式,通過正交實驗設(shè)計,以期實現(xiàn)縮短培養(yǎng)時間、提高生產(chǎn)效率、提高病毒產(chǎn)量的目的,為大規(guī)模流感疫苗生產(chǎn)提供了依據(jù)。 流感減毒活疫苗(LAIV)系在雞胚中生產(chǎn),并按照比例將H1N1型(A/17/California/2009/38)、 H3N2型(A/17/Perth/09/87)和B(B/56/Brisbane/60/08)型流感減毒活疫苗株配制成三價疫苗。本研究初步建立了采用MDCK細胞培養(yǎng)流感減毒活疫苗的工藝參數(shù)。當采用哺乳動物細胞生產(chǎn)流感疫苗時,由于病毒株已經(jīng)適應(yīng)了哺乳動物的生長條件,細胞法檢測結(jié)果可能與雞胚法存在差異。因此,本研究驗證了雞胚法(EID5o)檢測以MDCK細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的流感減毒活疫苗滴度的適用性。對其專屬性、線性、準確度、精密度、重復(fù)性、耐用性等方面進行了方法學驗證。結(jié)果表明,EID50方法具有高度特異性,同種型別中和抗體均可以有效地中和同種流感病毒,并且異種中和抗體不干擾病毒滴度的測定,制劑輔料對流感病毒滴度檢測結(jié)果無影響；方法線性良好,在線性范圍內(nèi),三種型別病毒的線性回歸系數(shù)(R2)在0.994～0.999之間；日間精密度的RSD值在1.65%-2.58%之間,平均回收率在97.3%～103.8%之間。采用EID50方法檢測以細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的三價流感減毒活疫苗病毒滴度,具有較高的可信性,能夠滿足流感疫苗生產(chǎn)廠家評價疫苗效力的需求。對于了解每種型別病毒穩(wěn)定性、免疫原性具有重要的意義。 為了考察雞胚法(EID50)及細胞法(TCIDso)檢測以細胞為基質(zhì)生產(chǎn)的流感病毒滴度的相關(guān)性,本研究分別采用TCID50及EID50兩種方法檢測A/17/California/2009/38、 A/17/Perth/09/87以及B/56/Brisbane/60/08三種型別流感病毒滴度。結(jié)果表明：TCID50法測定A/17/California/2009/38、 A/17/Perth/09/87以及B/56/Brisbane/60/08型流感病毒滴度(平均值±SD)分別為7.2±0.151gTCID50、7.5±0.171gTCID50及7.0±0.101gTCID50;EID50法測定結(jié)果分別為7.3±0.201gEID50、7.5±0.151gEID50及7.0±0.121gEID50;兩種方法檢測結(jié)果間未見無顯著性差異(P0.05),表明可以作為流感病毒滴度測定的替代方法。
【關(guān)鍵詞】：流感減毒活疫苗 微載體 MDCK TCID50 EID50 分析方法驗證
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略詞表11-12
• 第一章 緒論12-27
• 1.1 流感病毒概述12-16
• 1.2 流感疫苗概述16-23
• 1.3 生產(chǎn)流感病毒疫苗常用基質(zhì)23-26
• 1.4 立題依據(jù)及研究目標26-27
• 第二章 采用MDCK細胞培養(yǎng)流感病毒方法的建立27-37
• 2.1 材料與儀器27
• 2.1.1 藥品與試劑27
• 2.1.2 儀器設(shè)備27
• 2.2 實驗方法27-30
• 2.2.1 細胞復(fù)蘇27-28
• 2.2.2 細胞傳代及病毒接種28
• 2.2.3 微載體培養(yǎng)28-29
• 2.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化(流感病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化)29
• 2.2.5 流感病毒滴度測定(EID50法)29-30
• 2.3 實驗結(jié)果30-34
• 2.3.1 H1N1型流感病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果30-32
• 2.3.2 B型流感病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果32-33
• 2.3.3 H1N1及B型流感病毒培養(yǎng)條件評價33-34
• 2.4 討論34-36
• 2.5 結(jié)論36-37
• 第三章 流感病毒滴度測定方法雞胚法(EID_(50))的驗證37-51
• 3.1 材料與儀器37
• 3.1.1 藥品與試劑37
• 3.1.2 儀器37
• 3.2 實驗方法37-43
• 3.2.1 流感病毒滴度測定(EID50法)37
• 3.2.2 檢驗方法驗證37-43
• 3.2.2.1 樣品處理37-39
• 3.2.2.2 專屬性39-40
• 3.2.2.3 線性40-41
• 3.2.2.4 準確度41
• 3.2.2.5 精密度41-42
• 3.2.2.6 耐用性42-43
• 3.3 結(jié)果43-49
• 3.3.1 專屬性43-45
• 3.3.2 線性45-46
• 3.3.3 準確度46-47
• 3.3.4 精密度47-49
• 3.3.5 耐用性49
• 3.4. 討論49-50
• 3.5 結(jié)論50-51
• 第四章 EID_(50)法和TCID_(50)法測定結(jié)果相關(guān)性研究51-56
• 4.1 材料與儀器51
• 4.1.1 藥品與試劑51
• 4.1.2 儀器51
• 4.2 實驗方法51-54
• 4.2.1 細胞復(fù)蘇52
• 4.2.2 細胞傳代52
• 4.2.3 鋪96孔培養(yǎng)板52
• 4.2.4 感染52-53
• 4.2.5 病毒培養(yǎng)53
• 4.2.6 CPE檢測53-54
• 4.2.7 結(jié)果處理54
• 4.2.8 EID50法54
• 4.3 結(jié)果54-55
• 4.4 討論55
• 4.5 結(jié)論55-56
• 參考文獻56-60
• 附錄實驗用液體配制60-62
• 致謝62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 樊慶帥;牛紅星;吳書軍;張旭;譚文松;;無血清培養(yǎng)MDCK細胞生產(chǎn)狂犬病病毒條件的初步優(yōu)化[J];中國生物制品學雜志;2009年11期

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  本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用MDCK細胞表達流感減毒活疫苗（LAIV）和應(yīng)用雞胚檢測病毒滴度方法學驗證的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：265169