本文關鍵詞：單核細胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學特性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單核細胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes,LM)作為四大重要食源性病原菌之一,對人類及多種畜禽健康威脅極大,可以突破宿主的腸道屏障,血腦屏障和血胎屏障,臨床上引起腸胃炎、腦膜腦炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀,尤其是對幼齡和妊娠母畜,發(fā)病急,死亡率高。LM細胞胞壁表面分布多種毒力蛋白,在感染機體過程中發(fā)揮重要作用,其中有一類至關重要的表面蛋白的前體蛋白C端含有保守基序LPXTG,Srt A是一種分選酶能夠識別表面蛋白C末端的保守基序LPXTG,共價結(jié)合到肽聚糖上,呈現(xiàn)在細胞表面發(fā)揮毒力作用,是毒力蛋白可以錨定到細菌細胞壁過程中的關鍵。本研究以李斯特菌病綿羊腦組織臨床分離的單核細胞增多性李斯特菌(簡稱LM90SB2,4b血清型)為研究對象,首先對LM90SB2的srt A基因進行序列分析及原核表達;構(gòu)建LM90SB2的srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A),對比分析生化特性,生長特性,對小鼠和不同種屬類型細胞的毒力等生物學功能,為探究LM的Srt A分選的蛋白譜,尋找新的毒力蛋白研究奠定了重要基礎;在LM致病機理研究中和藥物靶標的篩選上同樣具有重要作用。1.LM90SB2 srt A基因的序列分析與原核表達:為了探究LM90SB2的srt A基因的特異性及其在原核表達質(zhì)粒p ET32a中的表達。利用PCR技術擴增LM90SB2的srt A基因,測序后用DANMAN軟件與已公布的標準株進行序列比對分析,將srt A克隆到原核表達質(zhì)粒p ET32a中構(gòu)成重組表達質(zhì)粒p ET32a-srt A。質(zhì)粒p ET32a-srt A轉(zhuǎn)化到蛋白表達菌株E.coli BL21(DE3)中,異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導使其表達,SDS-PAGE電泳檢測,同時采用Western-blotting對表達產(chǎn)物進行了鑒定。實驗結(jié)果表明:LM90SB2與標準株LMF2365(serovar 4b,NC_002973)srt A基因的核苷酸同源性為100%;Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表達,表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blotting檢測分析其為一個分子量為47k D的融合蛋白與預期的大小相符合。2.LM90SB2 srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A)的構(gòu)建與鑒定:基因缺失是研究基因功能常用的方法,本實驗利用同源重組的方法構(gòu)建LM90SB2 srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A),為研究LM的srt A基因的功能奠定基礎。用Primer 5.0軟件設計融合引物,PCR擴增LM90SB2 srt A基因的上下游同源臂,運用融合PCR(SOE-PCR)的方法連接上下臂獲得缺失srt A基因的同源片段(△srt A),連接到p MD19-T構(gòu)成p MD19-T-△srt A,基因測序結(jié)果正確后將△srt A克隆到質(zhì)粒p KSV7中構(gòu)成重組質(zhì)粒p KSV7-△srt A。將質(zhì)粒p KSV7-△srt A電轉(zhuǎn)化入LM90SB2中,篩選陽性克隆,在高溫和10μg/ml氯霉素抗性條件下連續(xù)傳代,發(fā)生同源重組,用兩對引物(srt AF1和srt AR2,srt AF和srt AR)PCR驗證缺失片段。再置于無抗性的30℃條件下連續(xù)傳代獲得穩(wěn)定的srt A基因缺失株LM90SB2-△srt A。在無氯霉素抗性的BHI液體培養(yǎng)基中,37℃,180 rpm條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)20代,PCR檢測無毒力返祖現(xiàn)象,表明該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。3.對比分析LM90SB2-△srt A部分生物學特性:對比分析缺失株LM90SB2-△srt A與野生株LM90SB2的部分生物學特性的差異,來探究srt A基因?qū)τ贚M90SB2毒力的影響。本實驗主要對比分析了細菌的生化特性、溶血效價、耐酸耐堿性、生物膜形成能力;對于MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC的粘附,侵襲和胞內(nèi)增殖能力以及對BALB/c小鼠的致病能力影響。結(jié)果表明:srt A基因的缺失后,LM90SB2的生化特性、耐酸耐堿性無變化;溶血效價、生物膜形成能力稍有差異;LM90SB2對不同細胞的粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖能力不同,對RAW264.7的感染效率最高,對腦細胞的感染效率相對較低;srt A基因缺失后顯著降低了LM90SB2對HBMEC,RAW264.7,SIEC細胞的粘附率和對MBMEC,RAW264.7,SIEC細胞的侵襲率(P0.05),對LM90SB2在MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC中的增殖趨勢未有明顯影響,但細菌含量有所降低;srt A基因缺失后LM90SB2對BALB/c雌性小鼠的LD50值升高了1.63個對數(shù)級,在感染了4天后小鼠的肝臟、脾臟和腦中的含菌量有所降低。表明srt A基因缺失后LM90SB2對細菌和細胞的侵染能力有所下降。
【關鍵詞】：單核細胞增多性李斯特菌 原核表達 同源重組 基因缺失 生物學特性
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61;R378
【目錄】：

• 全文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞表12-13
• 引言13-14
• 第一章 文獻綜述14-27
• 1. LM的一般特性14-18
• 1.1 LM的生物學特征14-15
• 1.2 LM的流行病學特征15-16
• 1.3 李斯特菌病的臨床癥狀16
• 1.4 李斯特菌病的診斷與防治16-18
• 2. LM的毒力因子及致病機制18-24
• 2.1 LM侵入細胞相關的主要毒力因子19-22
• 2.2 LM的毒力調(diào)控因子22-24
• 3.分選酶的研究進展24-27
• 3.1 分選酶的結(jié)構(gòu)與功能24-25
• 3.2 LM的分選酶蛋白25
• 3.3 分選酶的應用前景25-27
• 第二章 試驗部分27-59
• 實驗一 LM90SB2 srtA基因序列分析及原核表達27-35
• 摘要27-28
• 1.材料28
• 1.1 菌株、質(zhì)粒及引物28
• 1.2 主要試劑和儀器28
• 2.方法28-31
• 2.1 LM90SB2基因組DNA的制備及srtA基因的擴增28-29
• 2.2 E.coli DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞的制備（CaCl2）29
• 2.3 srtA基因與pMD19-T的連接29-30
• 2.4 重組原核表達質(zhì)粒pET32a-srtA的構(gòu)建30
• 2.5 srtA基因在E.coli BL21（DE3）中的表達30
• 2.6 Western-blotting鑒定重組蛋白30-31
• 3.結(jié)果31-34
• 3.1 LM90SB2 srtA基因的克隆及序列分析31
• 3.2 原核表達質(zhì)粒pET32a-srtA的鑒定31-32
• 3.3 srtA基因在E.coli BL21（DE3）中表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果32-33
• 3.4 表達產(chǎn)物Western-blotting分析結(jié)果33-34
• 4.討論34-35
• 實驗二 LM90SB2-△srtA缺失株的構(gòu)建35-47
• 摘要35
• 1.材料35-37
• 1.1 菌株、質(zhì)粒及引物35-36
• 1.2 主要試劑與儀器36-37
• 2.方法37-40
• 2.1 srtA基因上下游同源臂的擴增及SOE-PCR37-38
• 2.2 融合同源臂△srtA與pMD19-T的連接38
• 2.3 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△srtA的構(gòu)建38
• 2.4 電轉(zhuǎn)用LM 90SB2感受態(tài)細胞的制備38-39
• 2.5 pKSV7-△srtA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到LM90SB2感受態(tài)細胞中39
• 2.6 同源重組39-40
• 2.7 LM90SB2-△srtA基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性鑒定及生長特性40
• 3.結(jié)果40-46
• 3.1 srtA基因上下游同源臂的擴增和SOE-PCR結(jié)果40-41
• 3.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-△srtA和pKSV7-△srtA酶切鑒定結(jié)果41-42
• 3.3 電轉(zhuǎn)后陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定42-43
• 3.4 同源重組結(jié)果的篩選與鑒定43-45
• 3.5 LM90SB2-△srtA缺失株鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析和生長曲線測定結(jié)果45-46
• 4.討論46-47
• 實驗三 LM90SB2-△srtA缺失株部分生物學特性研究47-59
• 摘要47
• 1.材料47-48
• 1.1 菌株、細胞和實驗動物47-48
• 1.2 主要試劑和儀器48
• 2.方法48-51
• 2.1 生化特性鑒定48-49
• 2.2 溶血效價的測定49
• 2.3 耐酸耐堿生長曲線測定49
• 2.4 生物膜形成能力的測定49-50
• 2.5 對MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖實驗50
• 2.6 LD50的測定50-51
• 2.7 感染小鼠后肝、脾、腦載菌量的測定51
• 3.結(jié)果51-57
• 3.1 生化鑒定結(jié)果51
• 3.2 溶血效價的測定結(jié)果51-52
• 3.3 耐酸耐堿生長曲線52
• 3.4 生物膜形成能力的測定結(jié)果52-53
• 3.5 對MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附率、侵襲率和胞內(nèi)增殖能力53-55
• 3.6 LD50的測定結(jié)果55
• 3.7 感染小鼠后肝、脾、腦載菌量的測定結(jié)果55-57
• 4.討論57-59
• 全文結(jié)論59
• 主要創(chuàng)新點59-60
• 參考文獻60-68
• 附錄68-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71-72
• 附件72

【參考文獻】

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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  本文關鍵詞：單核細胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：264885