本文關(guān)鍵詞：原核表達(dá)醛（糖）還原酶及霍亂毒素類似嵌合蛋白的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本論文主要涉及了三個(gè)蛋白的基因克隆表達(dá)及相關(guān)抑制劑篩選的研究,主要包括與糖尿病綜合癥及炎癥相關(guān)的醛糖還原酶和醛還原酶,以及一種具有腦靶向作用的多亞基全新的霍亂毒素類似嵌合蛋白的基因克隆表達(dá)和純化,及采用醛糖還原酶和醛還原酶進(jìn)行抑制劑的篩選,主要得到的結(jié)果有以下三種。第一,醛糖還原酶(Aldehyde reductase AKR1B1, EC1.1.1.21)是醛酮還原酶家族成員,是多元醇通路的關(guān)鍵限速酶。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),AKR1B1與多種疾病有關(guān),在一系列的炎癥性疾病等中起著關(guān)鍵作用,與多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有直接的關(guān)系,可作為篩選非甾體抗炎藥物的新靶點(diǎn)。為了篩選相應(yīng)的酶抑制劑,為藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用提供參考,本研究構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-AKR1B1-(His)6,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)宿主菌中,通過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化,確定表達(dá)條件為0.175 mMIPTG、14℃、80 rpm誘導(dǎo)14h,重組蛋白以可溶和沉淀兩種形式表達(dá)。采用親和純化得到純度為93%的AKR1B1-(His)6融合蛋白。使用Western blotting蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,蛋白質(zhì)序列分析儀測(cè)定氨基酸序列片段與目的蛋白序列比對(duì)。利用體外酶動(dòng)學(xué)方法測(cè)定AKR1B1-(His)6的比活力為(9.4±0.23)U/mg。使用該蛋白建立醛還原酶抑制劑篩選方法,分別測(cè)定已上市的13種非甾體抗炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs,NSAIDs)對(duì)AKR1B1-(His)6的抑制活性。結(jié)果表明,萘普生、雙氯芬酸、氟滅酸、布洛芬等對(duì)融合蛋白AKR1B1-(His)6有較強(qiáng)的抑制作用,可與抗糖尿病并發(fā)癥藥物聯(lián)合用藥。醛還原酶(Aldehyde reductase AKR1A1, EC 1.1.1.2)是醛酮還原酶家族成員,能將有毒醛還原成相應(yīng)的醇。為研究非甾體抗炎藥對(duì)AKR1A1的抑制作用,為非甾體抗炎藥的副作用及臨床應(yīng)用提供參考,本研究構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b-(His)6-DDDD K-AKR1A1,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)宿主菌中,通過對(duì)表達(dá)條件的優(yōu)化,確定表達(dá)條件為0.25 mMIPTG,16℃,80 rpm誘導(dǎo)14h,重組蛋白以可溶形式表達(dá)。采用親和純化得到純度為90%的pelB-(His)6-DDDDK-AKR1A1融合蛋白。重組蛋白用腸激酶特異性剪切,經(jīng)過Ni-NTA、Sephadex G-75再次純化,得到純度為98%的野生型AKR1A1蛋白。使用Western blotting和蛋白質(zhì)序列分析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。利用體外酶動(dòng)學(xué)方法測(cè)定(His)6-DDDDK-AKR1A1的比活力為(41.3±0.1)U/mg、AKR1A1比活力為(79.4±0.15)U/mg。奧沙普秦、酮基布洛芬、氟滅酸、托芬那酸等對(duì)AKR1A1有很強(qiáng)的抑制作用,為抗炎藥副作用提供參考。為了得到一種具有腦靶向作用的多亞基蛋白質(zhì),本研究還使用原核共表達(dá)系統(tǒng),設(shè)計(jì)表達(dá)了一種全新的霍亂毒素類似嵌合蛋白。分別獲得重組質(zhì)粒pET-28a-CTB和pET-22b-EGFP-CTA2-TAT,利用pET-28a-CTB和pET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,將雙質(zhì)粒分步轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。優(yōu)化表達(dá)條件后,重組嵌合蛋白能以可溶形式表達(dá)。經(jīng)過Ni-NTA、Sephadex G-75純化,Western blotting對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,確定獲得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白,為該蛋白進(jìn)一步的入腦研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：醛糖還原酶 醛還原酶 組氨酸標(biāo)簽 非甾體抗炎藥 嵌合蛋自
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-12
• CONTENTS12-16
• 縮寫16-17
• 第一章 緒論17-24
• 1.1 醛酮還原酶家族命名17
• 1.2 醛糖還原酶17-19
• 1.2.1 醛糖還原酶的結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2.2 醛糖還原酶的分布18-19
• 1.2.3 醛糖還原酶的生理功能19
• 1.3 醛還原酶的介紹19-21
• 1.3.1 醛還原酶的結(jié)構(gòu)19-20
• 1.3.2 醛還原酶的分布20
• 1.3.3 醛還原酶的生理功能20-21
• 1.4 入腦蛋白設(shè)計(jì)21-24
• 1.4.1 霍亂毒素蛋白21-22
• 1.4.2 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白22
• 1.4.3 TAT蛋白22
• 1.4.4 腦靶向蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能22-24
• 第二章 醛糖還原酶的克隆、表達(dá)與研究24-50
• 2.1 引言24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器24-29
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒24
• 2.2.2 試劑24-25
• 2.2.3 溶液配制25-28
• 2.2.4 儀器28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-38
• 2.3.1 AKR1B1基因片段的獲得29
• 2.3.2 pET-22b(+)-AKR1B1重組表達(dá)載體構(gòu)建29-34
• 2.3.3 表達(dá)宿主菌的選擇34
• 2.3.4 測(cè)定Rosetta(DE3)的生長(zhǎng)曲線34
• 2.3.5 目的蛋白的表達(dá)34
• 2.3.6 目的蛋白的純化34-36
• 2.3.7 目的蛋白鑒定36
• 2.3.8 AKR1B1-(His)_6酶濃度測(cè)定36-37
• 2.3.9 重組AKR1B1-(His)_6酶活性測(cè)定及動(dòng)力學(xué)分析37-38
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論38-49
• 2.4.1 目的基因PCR擴(kuò)增38
• 2.4.2 pET-22b-AKR1B1-(His)_6表達(dá)載體的構(gòu)建38-42
• 2.4.3 表達(dá)菌種的選擇42-43
• 2.4.4 測(cè)定Rosetta(DE3)的生長(zhǎng)曲線43-44
• 2.4.5 目的蛋白的表達(dá)44-45
• 2.4.6 目的蛋白的純化45-46
• 2.4.7 目的蛋白鑒定46-47
• 2.4.8 目的蛋白氨基酸測(cè)序47
• 2.4.9 醛糖還原酶溶度測(cè)定47-48
• 2.4.10 醛糖還原酶活性測(cè)定48-49
• 2.5 本章小結(jié)49-50
• 第三章 醛還原酶的克隆、表達(dá)與活性測(cè)定50-63
• 3.1 引言50
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器50-51
• 3.2.1 菌株和質(zhì)粒50
• 3.2.2 試劑50
• 3.2.3 溶液配制50-51
• 3.2.4 儀器51
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法51-54
• 3.3.1 (His)_6-DDDDK-AKR1A1基因的優(yōu)化與合成51
• 3.3.2 pET-22b-(His)_6-DDDDK-AKR1A1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定51-52
• 3.3.3 融合蛋白的表達(dá)、純化及腸激酶切割52-53
• 3.3.4 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化53
• 3.3.5 目的蛋白鑒定53-54
• 3.3.6 重組AKR1A1酶活性測(cè)定及動(dòng)力學(xué)分析54
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論54-62
• 3.4.1 pET-22b-(His)_6-DDDDK-AKR1A1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建54-58
• 3.4.2 pe1B-(His)_6-DDDDK-AKR1A1表達(dá)、純化及腸激酶切割58-59
• 3.4.3 pe1B-(His)_6-DDDDK-AKR1A1重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化59-61
• 3.4.4 重組蛋白鑒定61
• 3.4.5 AKR1A1蛋白的活性測(cè)定61-62
• 3.5 本章小結(jié)62-63
• 第四章 非甾體抗炎藥對(duì)醛糖還原酶與醛還原酶抑制性的研究63-68
• 4.1 引言63
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器63-64
• 4.2.1 試劑63-64
• 4.2.2 溶液配制64
• 4.2.3 儀器64
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法64-65
• 4.3.1 非甾體抗炎藥物對(duì)AKR1B1的抑制研究64-65
• 4.3.2 非甾體抗炎藥物對(duì)AKR1A1的抑制研究65
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論65-67
• 4.4.1 抗炎藥對(duì)AKR1A1、AKR1B1的IC_(50)值測(cè)定65-67
• 4.5 本章小結(jié)67-68
• 第五章 不相容雙質(zhì)粒共表達(dá)霍亂毒素類似嵌合蛋白68-85
• 5.1 介紹68-69
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器69
• 5.2.1 菌株、質(zhì)粒69
• 5.2.2 試劑69
• 5.2.3 溶液配制69
• 5.2.4 儀器69
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法69-73
• 5.3.1 編碼CTB基因的工程菌構(gòu)建69-70
• 5.3.2 編碼EGFP-CTA2-TAT基因的工程菌構(gòu)建70
• 5.3.3 分步轉(zhuǎn)化獲得目的蛋白表達(dá)工程菌70-71
• 5.3.4 測(cè)定BL21(DE3)的生長(zhǎng)曲線71
• 5.3.5 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)71-72
• 5.3.6 目的蛋白鑒定72-73
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-84
• 5.4.1 pET-28a-CTB原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建73-76
• 5.4.2 pET-22b-EGFP-CTA2-TAT原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建76-79
• 5.4.3 分步轉(zhuǎn)化獲得目的蛋白表達(dá)工程菌79-81
• 5.4.4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定81
• 5.4.5 目的蛋白表達(dá)、純化81-83
• 5.4.6 目的蛋白的鑒定83-84
• 5.5 本章小結(jié)84-85
• 結(jié)論與展望85-87
• 參考文獻(xiàn)87-93
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文93-94
• 附錄94-98
• 致謝98

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張東威;金寧一;;HIV-1Gag-gp120嵌合基因在重組桿狀病毒系統(tǒng)中的嵌合表達(dá)[J];中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥;2009年35期

2 祖東,徐春曉,張智清,譚錦泉;TNF受體(P55)胞外區(qū)和IgGFc嵌合蛋白高效原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年02期

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4 徐春曉,姚立紅,黃國(guó)錦,柴映爽,陳愛s

本文編號(hào)：257204