本文關(guān)鍵詞：胞外ADP在病毒感染中的功能和機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來(lái),不斷爆發(fā)的禽流感、SARS、埃博拉等惡性病毒感染給各國(guó)人民帶來(lái)了恐慌,也給現(xiàn)代醫(yī)療體系帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn),如何預(yù)防、控制病毒性疾病的傳播成為我們迫切需要解決的重大科學(xué)問(wèn)題。而深入開(kāi)展病毒對(duì)宿主的感染途徑以及機(jī)體的抗病毒機(jī)制研究是解決這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵。眾所周知,干擾素是宿主抵抗病毒感染過(guò)程中最重要的效應(yīng)分子,它通過(guò)誘導(dǎo)下游300多種干擾素誘導(dǎo)基因(Interferon stimulated gene, ISGs)的表達(dá)來(lái)抵抗病毒的感染。本課題首先利用重組人IFN-a 2a刺激人外周血單核細(xì)胞,并采用Affymetrix公司的GeneChip(?) Human Transcriptome Array 2.0 (HTA2.0)對(duì)245,000個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行系統(tǒng)篩查,發(fā)現(xiàn)嘌呤受體家族重要成員P2Y12和P2Y13的表達(dá)顯著提高,呈現(xiàn)出典型的干擾素誘導(dǎo)基因的特征。隨后我們?cè)诓《靖腥竞蟮募?xì)胞中也進(jìn)一步明確P2Y13在病毒感染過(guò)程中表達(dá)上調(diào)。這提示我們嘌呤受體P2Y12和P2Y13在病毒感染過(guò)程中可能具有重要作用。嘌呤受體是一類(lèi)以胞外核苷酸為特異性配體的細(xì)胞膜受體分子,近年來(lái)發(fā)現(xiàn)其在神經(jīng)、心血管以及免疫功能中都發(fā)揮重要作用。有趣的是P2Y12和P2Y13雖然是不同的嘌呤受體,但是它們的配體卻都是ADP。為此我們對(duì)病毒感染過(guò)程中胞外ADP的釋放進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示隨著病毒的感染,胞外ADP的釋放明顯增多。這一特征進(jìn)一步將我們的研究目標(biāo)指向了胞外ADP及其受體P2Y12和P2Y13。因此我們分別在病毒感染的不同階段對(duì)ADP及其受體的抗病毒功能進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。首先,利用熒光定量PCR對(duì)病毒的數(shù)量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果ADP不會(huì)顯著影響VSV的入侵過(guò)程。但是,如果我們?cè)诓《竞笃趶?fù)制過(guò)程中也保持ADP的刺激,ADP處理后的細(xì)胞中VSV的數(shù)目就會(huì)明顯降低。這提示我們ADP的抗病毒作用可能主要集中在病毒感染的中后期,而這種抑制作用同樣也在NDV、HSV、Lentivirus等不同病毒的感染過(guò)程中發(fā)現(xiàn)。進(jìn)而我們?cè)赩SV感染的小鼠動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)了ADP的重要抗病毒功能。為進(jìn)一步明確ADP的抗病毒機(jī)制,我們首先對(duì)其作用受體進(jìn)行篩選。目前已知ADP的受體有三個(gè)P2Y1, P2Yi2和P2Y13。其中P2Y1主要激活PLC-β,而P2Y12和P2Y13主要抑制cAMP的合成。因此我們首先通過(guò)Forskolin激活腺苷酸環(huán)化酶,從而提高胞內(nèi)cAMP含量以及U73122抑制PLC-β來(lái)阻斷不同嘌呤受體的信號(hào)通路,然后再用VSV對(duì)細(xì)胞感染。結(jié)果表明：Forskolin能夠顯著抑制ADP的抗病毒功能,而U73122卻沒(méi)有明顯作用。這提示我們ADP的抗病毒功能主要是通過(guò)P2Y12和P2Y13激活后抑制cAMP信號(hào)通路來(lái)完成的。同時(shí)我們利用CRISPRs的技術(shù)分別構(gòu)建了P2Y1、P2Y12、P2Y13敲除小鼠。當(dāng)野生型小鼠BMDM(骨髓來(lái)源誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞)以及P2Yi、P2Yi2、P2Yi3敲除小鼠BMDM同時(shí)感染相同劑量VSV病毒時(shí),只有P2Y13敲除小鼠BMDM相對(duì)于野生型小鼠BMDM感染病毒明顯增加。因此,P2Y13在A(yíng)DP抗病毒功能中是一個(gè)重要的受體。并且,在P2Y12敲除小鼠中P2Y13表達(dá)上調(diào),其抗病毒功能也相對(duì)野生型小鼠也更加明顯。因此,我們認(rèn)為P2Y13是ADP抗病毒功能的主要受體。細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP在調(diào)控細(xì)胞生理功能中發(fā)揮了十分重要的作用,但關(guān)于其在病毒感染中的功能卻較少有報(bào)道,因此ADP如何通過(guò)cAMP來(lái)調(diào)控抗病毒功能成為我們接下來(lái)研究的重點(diǎn)。我們通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：病毒感染細(xì)胞過(guò)程中cAMP以及Epac1基因表達(dá)明顯上調(diào),并且ESI09(Epac1的抑制劑)能夠明顯抑制病毒核酸的復(fù)制。這提示我們ADP極有可能是通過(guò)與P2Y13的結(jié)合來(lái)抑制病毒誘導(dǎo)的cAMP/Epac1表達(dá),從而阻止病毒在胞內(nèi)的復(fù)制。綜上所述,病毒感染過(guò)程中伴隨著ADP的大量釋放以及其受體P2Y13的表達(dá)上調(diào),而這些釋放出來(lái)的ADP通過(guò)與細(xì)胞表面的P2Y13受體結(jié)合,進(jìn)而抑制胞內(nèi)cAMP以及Epacl相關(guān)信號(hào)通路,最終達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。我們的研究從胞外危險(xiǎn)信號(hào)釋放以及嘌呤受體激活的角度對(duì)機(jī)體的抗病毒機(jī)制進(jìn)行了深入研究,明確了胞外ADP及其受體在病毒感染中的重要調(diào)控作用,為病毒性疾病的預(yù)防和相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：病毒 干擾素誘導(dǎo)基因 ADP 嘌呤受體 cAMP
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373
【目錄】：

• 內(nèi)容摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 引言13-18
• 一、病毒性疾病嚴(yán)重危害社會(huì)公共衛(wèi)生安全13
• 二、干擾素誘導(dǎo)基因(ISGs)是抗病毒研究的重要靶標(biāo)13-14
• 三、內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)胞外核苷酸具有重要的生理、病理功能14-15
• 四、嘌呤受體是胞外核苷酸作用的主要途徑15-17
• 五、課題研究目的及意義17-18
• 第二章 病毒感染引起核苷酸釋放及其受體表達(dá)上調(diào)18-29
• 第一節(jié) 材料與方法18-24
• 一、實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 二、實(shí)驗(yàn)方法20-24
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 一、VSV病毒感染細(xì)胞后會(huì)引起胞外核苷酸的釋放24-25
• 二、胞外核苷酸ADP受體P2Y_(12),P2Y_(13)是干擾素誘導(dǎo)基因25-27
• 三、病毒感染引起ADP受體P2Y_(12),P2Y_(13)表達(dá)上調(diào)27-29
• 第三章 ADP抑制病毒在細(xì)胞和小鼠組織中復(fù)制29-47
• 第一節(jié) 材料與方法29-39
• 一、實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 二、實(shí)驗(yàn)方法31-39
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-47
• 一、胞外ADP不影響VSV病毒的入侵過(guò)程39-40
• 二、胞外ADP影響病毒的復(fù)制過(guò)程40-46
• 三、在動(dòng)物水平探索胞外ADP的抗病毒功能46-47
• 第四章 P2Y_(13)是ADP抗病毒功能的主要受體47-60
• 第一節(jié) 材料與方法47-52
• 一、實(shí)驗(yàn)材料47-49
• 二、實(shí)驗(yàn)方法49-52
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-60
• 一、構(gòu)建P2Y_1,P2Y_(12),P2Y_(13)的敲除小鼠52-55
• 二、在A(yíng)DP執(zhí)行抗病毒功能的過(guò)程中P2Y_1不是主要的受體55-57
• 三、P2Y_(13)在A(yíng)DP抗病毒過(guò)程中是主要受體57-60
• 第五章 ADP抗病毒功能的主要機(jī)制60-73
• 第一節(jié) 材料與方法60-66
• 一、實(shí)驗(yàn)材料60-62
• 二、實(shí)驗(yàn)方法62-66
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-73
• 一、ADP正常實(shí)驗(yàn)濃度對(duì)細(xì)胞增殖影響不明顯66-67
• 二、ADP對(duì)干擾素的表達(dá)影響不明顯67-68
• 三、ADP通過(guò)抑制cAMP的合成從而抑制Epac1最終抑制病毒的復(fù)制68-73
• 第六章 研究小結(jié)與展望73-75
• 參考文獻(xiàn)75-77
• 附錄Ⅰ 縮略詞77-79
• 附錄Ⅱ 攻讀碩士學(xué)位期間科研工作成果79-80
• 致謝80-81

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;禽肺病毒感染的診斷[J];國(guó)外畜牧學(xué)(豬與禽);2000年02期

2 趙林清,錢(qián)淵;EB病毒感染及其相關(guān)疾病[J];中華兒科雜志;2003年10期

3 饒軍華,劉曉明,王海英,多海剛,田克恭;B病毒感染的預(yù)防和治療方法[J];中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志;2005年04期

4 趙樸;鄭玉姝;劉興友;;泛素-蛋白酶體途徑在病毒感染中的作用[J];生物技術(shù)通報(bào);2007年06期

5 姜國(guó)勝,唐天華;病毒感染和胰島素依賴(lài)型糖尿病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè);1990年01期

6 陳阿英,凌天翼,唐俊杰;正常小鼠病毒感染的調(diào)查[J];貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1997年02期

7 李?lèi)?ài)春;肥胖可能與病毒感染有關(guān)[J];中國(guó)病毒學(xué);2003年06期

8 章漳;王碩;邱宏;王崢濤;丁侃;;硫酸乙酰肝素蛋白聚糖與病毒感染[J];中國(guó)醫(yī)療前沿;2009年03期

9 楊敬,戰(zhàn)大偉;人和猴的B病毒感染[J];實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理;2004年01期

10 ;本年度全球艾滋病病毒感染者新增500萬(wàn)[J];生物學(xué)通報(bào);2005年12期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 魏文憑;;小兒EB病毒感染的臨床觀(guān)察及治療[A];第六屆江浙滬兒科學(xué)術(shù)會(huì)議暨兒科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展學(xué)術(shù)班論文匯編[C];2009年

2 饒軍華;劉曉明;王海英;多海剛;田克恭;;預(yù)防和治療B病毒感染的方法[A];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2004年

3 鄭靜;邱艷;高波;夏紅英;;北京地區(qū)獻(xiàn)血者HIV病毒感染狀況調(diào)查研究[A];中國(guó)輸血協(xié)會(huì)第三屆輸血大會(huì)論文專(zhuān)輯[C];2004年

4 張潔;張小艷;;西安市2000-2006年病毒感染患者病原抗體檢測(cè)分析[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2006年

5 張慧;李雙杰;袁遠(yuǎn)宏;;兒童EB病毒感染不同臨床類(lèi)型免疫功能的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2012年

6 ;EB病毒感染與血液疾病[A];2013年國(guó)家級(jí)“惡性血液系統(tǒng)疾病診治新進(jìn)展”學(xué)習(xí)班暨學(xué)術(shù)年會(huì)資料匯編[C];2013年

7 劉業(yè)強(qiáng);吳飛;莫小輝;張黎明;蔡啟良;;EB病毒感染相關(guān)的皮膚病[A];2014全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2014年

8 張慧;李雙杰;袁遠(yuǎn)宏;唐蓮;姚娟;;兒童EB病毒感染不同臨床類(lèi)型免疫功能研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十七次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2012年

9 楊占秋;;病毒感染的生態(tài)學(xué)[A];湖北省暨武漢市微生物學(xué)會(huì)分析微生物專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第十屆第五次學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

10 甄小芳;;中藥治療急性EB病毒感染的研究[A];第二十九次全國(guó)中醫(yī)兒科學(xué)術(shù)大會(huì)暨“小兒感染性疾病的中醫(yī)藥防治”培訓(xùn)班論文匯編[C];2012年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 ;云南：在“家”字上著力開(kāi)展防艾禁毒活動(dòng)[N];中國(guó)婦女報(bào);2009年

2 常麗君;700年前病毒感染了活植物[N];科技日?qǐng)?bào);2014年

3 健康時(shí)報(bào)特約記者　姚麗萍;病毒感染能導(dǎo)致肥胖[N];健康時(shí)報(bào);2005年

4 記者 朱玉;男性為主 青壯年為主[N];新華每日電訊;2001年

5 戴欣 李媛媛;首屆全國(guó)病毒感染與器官功能衰竭研討會(huì)召開(kāi)[N];科技日?qǐng)?bào);2012年

6 錢(qián)峰 鄭靈巧;確保艾滋病人及家庭得到幫扶[N];健康報(bào);2006年

7 王振嶺;春季當(dāng)防病毒感染[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2006年

8 孫剛;上海新報(bào)告病毒感染者582例[N];解放日?qǐng)?bào);2007年

9 記者 蔣仕麗;云南做細(xì)染艾者關(guān)懷救助工作[N];健康報(bào);2012年

10 吳錚;美國(guó)專(zhuān)家稱(chēng)“病毒感染”可引起肥胖[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 王開(kāi)發(fā);病毒感染動(dòng)力學(xué)模型分析[D];西南大學(xué);2007年

2 毛曉健;2005-2007年廣州兒童醫(yī)院住院肺炎患兒三種病毒感染的臨床特征[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

3 張穎;淋巴細(xì)胞HIV-1輔受體的表型剔除對(duì)病毒感染的阻斷作用[D];中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

4 李建蓉;靜脈藥癮者T細(xì)胞亞群變化與多重病毒感染關(guān)系的研究[D];華中科技大學(xué);2006年

5 陳玉會(huì);Heterotypic cell-in-cell結(jié)構(gòu)在炎癥、癌癥以及病毒感染與傳播中相關(guān)機(jī)制的研究[D];華南理工大學(xué);2013年

6 孫利;CD34~+人造血干細(xì)胞（hHSC）HIV-1輔受體的表型剔除對(duì)病毒感染的阻斷作用[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2008年

7 黎耀強(qiáng);中醫(yī)治療艾滋病研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 楊益;廣譜病毒感染抑制劑的篩選及其作用機(jī)制的初步研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

2 王玲玲;155例EB病毒感染住院患兒的臨床特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室檢查分析[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

3 孫巧麗;湖北省艾滋病病毒感染者/病人歧視現(xiàn)狀及其就醫(yī)告知情況研究[D];武漢科技大學(xué);2015年

4 戴欣;重慶地區(qū)MSM人群EB病毒感染血清流行病學(xué)調(diào)查研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

5 羅鳳媛;中西醫(yī)結(jié)合治療小兒EB病毒感染臨床觀(guān)察[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2015年

6 閆艷;胞外ADP在病毒感染中的功能和機(jī)制研究[D];華東師范大學(xué);2015年

7 李長(zhǎng)美;兒童非典型EB病毒感染的臨床分析[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

8 張春艷;152例EB病毒感染住院患兒的臨床研究[D];吉林大學(xué);2011年

9 王文輝;異基因外周血造血干細(xì)胞移植后病毒感染的臨床分析[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2013年

10 胡晨e

本文編號(hào)：257080