本文選題：淋球菌 + 重組NspA　； 參考：《南華大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：構(gòu)建pGEX-6p-1/nspA原核重組載體，表達并純化GST-NspA重組蛋白，探討NspA誘導(dǎo)人單核細胞（THP-1）產(chǎn)生炎性細胞因子IL-1β、TNF-α和HMGB1的潛在能力及其誘導(dǎo)THP-1細胞凋亡程度的影響。 方法：通過Genbank獲取淋球菌NspA蛋白的基因序列，以WHO-E株全基因組DNA為模板，通過PCR擴增得到目的片段，雙酶切后連接到原核表達載體pGEX-6p-1質(zhì)粒上，經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL-21中，分別用IPTG濃度為0.2、0.5、0.8、1.0、1.2mmol/L，在不同溫度下（13℃、20℃、25℃、30℃、37℃）誘導(dǎo)蛋白表達；采用SDS-PAGE分析和Western blot鑒定表達產(chǎn)物，GST-Bind樹脂柱純化重組蛋白，經(jīng)BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，用多粘菌素B去除純化蛋白中的內(nèi)毒素。以不同濃度NspA重組蛋白刺激THP-1分別作用不同的時長，采用ELISA法檢測THP-1分泌促炎細胞因子HMGB1、IL-1β和TNF-α的水平。用不同濃度的NspA處理THP-1細胞，經(jīng)AnnexinV-EGFP-PI雙染法染色后，用熒光顯微鏡觀測在不同刺激時間下的細胞凋亡形態(tài)上的變化，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。 結(jié)果：PCR擴增出淋球菌WHO-E株NspA基因目的片段，構(gòu)建pGEX-6p-1/nspA原核重組載體，經(jīng)酶切和測序鑒定證實與GenBank上GI：215260662序列完全一致。在IPTG濃度為0.8mmol/L、25℃誘導(dǎo)4.5h可得到重組表達菌表達NspA可溶性蛋白的最佳狀態(tài)，獲得了相對分子量約為44kDa的重組蛋白，，選取菌體超聲后的上清，經(jīng)GST-Bind樹脂柱親和純化后得到NspA純化蛋白；經(jīng)BCA試劑盒檢測蛋白濃度為463μg/mL，經(jīng)多粘菌素B處理重組蛋白去除內(nèi)毒素后，鱟試驗檢測內(nèi)毒素含量小于0.05EU/mL。2、4、8、16、32μg/mL的NspA重組蛋白均能誘導(dǎo)THP-1產(chǎn)生不同水平的IL-1β、TNF-α和HMGB1，并呈劑量依賴性，同時也隨著刺激時長的增加而變化。NspA的刺激濃度在8μg/mL作用48h時，TNF-α的量達到138pg/mL的峰值，與PBS/GST對照組及其它各平行組之間比較均有顯著差異(P0.05)。在NspA刺激濃度4μg/mL作用時長24h時、8μg/mL刺激48h時，IL-1β分別達到約56pg/mL的峰值，與PBS/GST對照組及其它各平行組之間比較均有顯著差異(P0.05)。HMGB1的分泌量隨時間的延長而增加，在NspA刺激60h時，HMGB1的分泌量達到峰值，與PBS/GST對照組及其它各平行組之間比較均有顯著差異(P0.05)。用4、8、16、32、64μg/mL NspA重組蛋白刺激THP-1細胞作用不同的時間梯度，經(jīng)AnnexinV-EGFP-PI雙染法染色后熒光顯微鏡觀察，隨著作用時間的延長及蛋白刺激濃度的升高，凋亡的細胞明顯增多。通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示隨著作用時間的延長及蛋白刺激濃度的升高，細胞凋亡百分率有明顯的變化，在刺激蛋白濃度為16μg/mL作用24h的時候凋亡百分率達到峰值為18.27%，與PBS/GST對照組及其它各平行組比較均有顯著差異(P0.05)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了pGEX-6p-1/NspA原核表達載體，制備出可溶性的高純度NspA重組蛋白。 2. NspA重組蛋白能促進THP-1細胞分泌炎癥因子IL-lβ、TNF-α、HMGB1。 3. NspA重組蛋白能誘導(dǎo)THP-1細胞發(fā)生凋亡。
[Abstract]:Objective: to construct pGEX-6p-1/nspA Prokaryotic Recombinant Vector, express and purify GST-NspA recombinant protein, and explore the potential ability of NspA induced human mononuclear cells (THP-1) to produce inflammatory cytokines IL-1 beta, TNF- alpha and HMGB1 and the effect of inducing the degree of apoptosis of THP-1 cells.
Methods: the gene sequence of gonococcal NspA protein was obtained by Genbank, and the target fragment was amplified by PCR with the whole genome DNA of WHO-E strain. After double enzyme digestion, it was connected to the pGEX-6p-1 plasmid of the prokaryotic expression vector, and then transformed into E.coli BL-21 to express the host bacteria by sequencing, and the concentration of IPTG was 0.2,0.5,0.8,1.0,1.2mmol/L, respectively. The protein expression was induced at different temperatures (13, 20, 25, 30, 37). The expression products were identified by SDS-PAGE analysis and Western blot, the recombinant protein was purified by the GST-Bind resin column, the concentration of protein was determined by the BCA protein concentration detection kit and the endotoxin in the purified protein was removed by the polymyxin B. The recombinant protein was stimulated with different concentrations of NspA. THP-1 was used to determine the level of THP-1 secreting proinflammatory cytokines HMGB1, IL-1 beta and TNF- alpha by ELISA method respectively. THP-1 cells were treated with NspA with different concentrations. After dyeing with AnnexinV-EGFP-PI double staining, the morphological changes of apoptosis in different stimulation time were observed by fluorescence microscope, and the flow cytometry was used to detect the changes of cell apoptosis in different stimuli time. Cell apoptosis.
Results: the target fragment of NspA gene of gonococcus WHO-E strain was amplified by PCR, and the pGEX-6p-1/nspA prokaryotic recombinant vector was constructed. The GI:215260662 sequence on GenBank was confirmed by enzyme digestion and sequencing. The optimum state of the expression of NspA soluble protein expressed by recombinant expression bacteria was obtained at IPTG concentration as 0.8mmol/L, and at 25 degrees C, the relative expression of NspA soluble protein was obtained. The recombinant protein with a molecular weight of about 44kDa was selected to select the supernatant after the bacterial ultrasound, and the purified protein was purified by the affinity purification of the GST-Bind resin column. The concentration of the protein was 463 u g/mL by the BCA kit. After the recombinant protein was treated with the polymyxin B to remove the endotoxin, the lysate test detected the content of the endotoxin in NspA less than 0.05EU/mL.2,4,8,16,32 u g/mL. Histone can induce THP-1 to produce different levels of IL-1 beta, TNF- alpha and HMGB1, and it is dose-dependent. At the same time, the concentration of TNF- A is up to the peak of 138pg/mL when the stimulation concentration of.NspA is increased at 8 mu g/mL, and there are significant differences (P0.05) between the PBS/GST control group and the other parallel groups (P0.05). When the concentration of A was 4 mu g/mL for long 24h, when 8 g/mL stimulated 48h, IL-1 beta reached a peak of about 56pg/mL, and there was a significant difference between the PBS/GST control group and the other parallel groups (P0.05) the secretion of.HMGB1 increased with the prolongation of time. The comparison of the parallel groups was significantly different (P0.05). 4,8,16,32,64 micron NspA recombinant protein was used to stimulate the different time gradient of THP-1 cells, and the apoptotic cells were obviously increased with the prolongation of the action time and the increase of the concentration of protein stimulated by the AnnexinV-EGFP-PI double staining method. The flow cytometry was used. The results showed that the percentage of apoptosis was significantly changed with the prolongation of action time and the increase of protein stimulation concentration. The percentage of apoptosis reached a peak of 18.27% when the concentration of stimulant protein was 16 g/mL 24h, which was significantly different from that of the PBS/GST control group and its parallel groups (P0.05).
Conclusion:
1. the prokaryotic expression vector of pGEX-6p-1/NspA was successfully constructed, and soluble high purity NspA recombinant protein was prepared.
2. NspA recombinant protein can promote THP-1 cells to secrete inflammatory cytokines IL-l beta, TNF- alpha, HMGB1.
3. NspA recombinant protein can induce apoptosis in THP-1 cells.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2093334