近年來,肉制品摻假事件頻頻發(fā)生,亟需建立快速、可靠的肉制品動(dòng)物源性成分檢測方法,保障肉類食品安全。與常規(guī)PCR等檢測方法相比,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有高特異性、高靈敏度、反應(yīng)快、易操作等優(yōu)勢�；诖�,利用生物信息算法篩選普通牛及其近緣種（牦牛、水牛、美洲野牛）的全基因組序列,以獲得種間相似性序列,進(jìn)而建立并優(yōu)化可用于檢測普通牛及其近緣種成分的特異性LAMP方法。最終優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系為:10μmol·L^-1外引物F3和B3各0.25μL,10μmol·L^-1內(nèi)引物FIP和BIP各2μL,2 mmol·L^-1 dNTP 2.5μL,25 mmol·L^-1 MgSO₄ 4μL,5 mol·L^-1甜菜堿3.5μL,8.0 U·μL^-1 Bst DNA聚合酶1μL,10×ThermoPol Buffer 2.5μL,DNA模板2μL,加雙蒸水至25μ... 

【文章來源】：生物技術(shù)進(jìn)展. 2020,10(06)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)溫度優(yōu)化

為了鑒定建立的LAMP方法的靈敏度,以梯度稀釋的普通牛及其近緣種DNA為模板,采用優(yōu)化好的LAMP體系,進(jìn)行靈敏度分析。靈敏度結(jié)果顯示(圖3):以普通牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中,在20.000～0.020 ng·μL-1樣本中,具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng),在0.002 ng·μL-1樣本中無擴(kuò)增和顏色變化;以牦牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中,在20.000～0.200 ng·μL-1為模板的樣本中,具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng),在0.020和0.002 ng·μL-1L樣本中無擴(kuò)增和顏色變化;以水牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中,在20.000～0.200 ng·μL-1樣本中,具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng),在0.020和0.002 ng·μL-1樣本中無擴(kuò)增和顏色變化;以美洲野牛的梯度稀釋DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)中,在20.000～0.020 ng·μL-1樣本中,具有典型的階梯型條帶擴(kuò)增和綠色的顏色反應(yīng),在0.002 ng·μL-1樣本中無擴(kuò)增和顏色變化。綜合普通牛及其近緣種梯度稀釋DNA樣品的檢測結(jié)果,表明建立的LAMP檢測方法的靈敏為0.020 ng·μL-1。2.4 實(shí)際樣品檢測

為了驗(yàn)證本研究建立的LAMP方法的實(shí)際應(yīng)用效果,以含有牛、羊、豬、雞、鴨等不同成分的市售肉制品為模板,進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。結(jié)果顯示:在6個(gè)含有牛肉成分的樣品中擴(kuò)增獲得階梯型條帶,反應(yīng)顏色從橙色變?yōu)榫G色;在不含牛肉成分的其余10個(gè)樣品中無擴(kuò)增條帶,反應(yīng)顏色為橙色(圖4)。實(shí)際樣品檢測結(jié)果表明建立的LAMP方法可以用于市售肉及其制品中牛肉成分的檢測。3 討論

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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