目的:本研究根據(jù)抗原-抗體特異性識別反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）的原理,構(gòu)建一種基于量子點（Quantum dots,QDs）的新型熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱檢測番茄醬中羅丹明B（Rhodamine B,RB）殘留。方法:通過羅丹明B的單克隆抗體與溴化氫活化瓊脂糖凝膠-4B偶聯(lián)制備分析物抗體膠,設(shè)計單檢測層的凝膠檢測柱。基于抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng),并利用羅丹明B和量子點之間的靜電引力作用,構(gòu)建一種新型的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱。通過優(yōu)化抗體添加量、量子點稀釋倍數(shù)、孵育時間以及上樣量等參數(shù),最終實現(xiàn)番茄醬樣品中羅丹明B的快速靈敏檢測。結(jié)果:當(dāng)1.0 g溴化氫活化的瓊脂糖凝膠添加2.0 mg羅丹明B單克隆抗體,量子點溶液稀釋3000倍,孵育時間控制在50 s,羅丹明B上樣量為3.0 mL,該熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱針對羅丹明B的方法檢測限（limit of detection,LOD）能夠達到最小值1.0μg/L。樣品分析結(jié)果表明,該方法針對番茄醬樣品中羅丹明B的檢測限為5.0μg/kg,并且與HPL... 

【文章來源】：食品工業(yè)科技. 2020,41(20)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

羅丹明B熒光猝滅免疫

本研究基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理,建立了一種針對番茄醬中非法著色劑羅丹明B進行快速檢測的熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱方法,其原理如圖1所示。首先將特異性識別羅丹明B的單克隆抗體與溴化氫活化瓊脂糖凝膠-4B偶聯(lián)制備檢測柱的檢測層。當(dāng)加入含有羅丹明B樣品時,羅丹明B就被抗體特異性的吸附到檢測層。再向體系中加入適量的羧基化ZnCdSe/ZnS量子點,這時由于量子點表面富含羧基,羧基為陰離子,帶有負電荷,羅丹明B是帶有正電荷的雜環(huán)堿性染料,兩者之間能夠通過靜電引力的相互作用緊密結(jié)合在一起,滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移的對距離的要求。同時ZnCdSe/ZnS量子點的最大熒光發(fā)射波長(532 nm)與羅丹明B最大吸收波長(554 nm)發(fā)生重疊,能夠滿足熒光共振能量轉(zhuǎn)移的光譜重疊的要求。這時量子點與羅丹明B發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,出現(xiàn)量子點(綠色熒光)熒光猝滅而羅丹明B熒光(紅色熒光)增強的現(xiàn)象。樣品中羅丹明B含量越多,與抗體特異性結(jié)合越多,在檢測層中與量子點溶液發(fā)生熒光猝滅越明顯,檢測層觀察到的量子點(綠色熒光)熒光猝滅而羅丹明B熒光(紅色熒光)增強現(xiàn)象越明顯。本研究根據(jù)檢測層中熒光亮度變化為本實驗的檢測指標(biāo),當(dāng)檢測層中的綠色熒光發(fā)生明顯變化,此時對應(yīng)的濃度確立為羅丹明B的檢測限。2.2 量子點熒光猝滅免疫親和凝膠檢測柱條件優(yōu)化

在制備分析物抗體膠的過程中,抗體添加量過少或過多,抗原抗體的特異性結(jié)合會受到影響,結(jié)合到分析膠上的抗體越多,檢測層富集分析物的能力越強,因此在相同熒光強度下方法的靈敏度也就越高。然而,抗體添加量過多,不僅會導(dǎo)致實驗成本的提高,而且過多的抗體會導(dǎo)致凝膠上抗體蛋白分布不均或自聚集影響實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。因此,分析物抗體膠制備過程中抗體添加量是非常重要的因素。分別取不同量的羅丹明B單克隆抗體(0、1.0、2.0和3.0 mg)與固定量1.0 g的溴化氫活化的瓊脂糖凝膠發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)制備檢測層,固定羅丹明B添加濃度(3.0 μg/L)、上樣體積(1.0 mL)以及量子點濃度(稀釋3000倍)等其他條件,按上述實驗方法進行樣品操作,在紫外分析儀365 nm的UV光照下,選擇導(dǎo)致熒光強度明顯變化的最小抗體添加量作為抗體膠中最佳抗體量。結(jié)果如圖2所示,2.0 mg羅丹明B單克隆抗體與1.0 g的瓊脂糖凝膠結(jié)合,檢測層中的綠色熒光完全消失,熒光淬滅現(xiàn)象明顯。因此,選擇2.0 mg羅丹明B單克隆抗體(每1.0 g溴化氫活化的瓊脂糖凝膠)為分析物抗體膠中抗體量的最優(yōu)值。2.2.2 量子點稀釋倍數(shù)的確定

【參考文獻】：
期刊論文
[1]量子點標(biāo)記免疫親和凝膠柱快速檢測動物組織中恩諾沙星[J]. 李詩潔,生威,王俊平,劉越,張燕,王碩.  中國食品學(xué)報. 2018(10)
[2]食品中羅丹明B快速檢測方法的建立與實現(xiàn)[J]. 阮成旭,陳梅蘭,王曉麗,彭善杰,林欽,李昊.  中國食品學(xué)報. 2015(06)
[3]高效液相色譜法測定辣椒粉中羅丹明B的測量不確定度評估[J]. 牛華,牛之瑞,馮雷,魯燕驊,馬雪濤,譚建林,張學(xué)忠,俸金梅.  食品科學(xué). 2014(08)
[4]超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)調(diào)味品中的羅丹明B、結(jié)晶紫和孔雀石綠[J]. 張貞理,張平,申大忠.  分析化學(xué). 2012(03)
[5]臘腸中羅丹明B的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法[J]. 程慧,李兵,占春瑞.  食品科學(xué). 2010(04)

博士論文
[1]食品安全分析中快速質(zhì)譜方法及應(yīng)用研究[D]. 楊子輝.湖南師范大學(xué) 2019

碩士論文
[1]孔雀石綠和結(jié)晶紫的免疫檢測新方法研究[D]. 陳義元.天津科技大學(xué) 2018



本文編號：3460740