本文關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷中Syntaxin-1A的作用及保護性藥物篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:圍術(shù)期心臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)發(fā)生率高,在非心臟手術(shù)中的發(fā)生率也達到1%-4%,而且預(yù)后不良,增加了住院病人的發(fā)病率和死亡率。多種方法和藥物,包括缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IPC)和腺苷(adenosine)等,都用于減少圍術(shù)期心肌缺血再灌注的發(fā)生以改善病人的預(yù)后。除此之外,吸入性全麻藥如異氟烷和七氟烷也具備心肌缺血再灌注損傷的保護作用。然而吸入性全麻藥和缺血預(yù)處理的作用機制仍不清楚,而且對于臨床圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷仍缺乏有效的治療手段。吸入性全麻藥和缺血預(yù)處理通過相似的細(xì)胞信號通路發(fā)揮作用,例如PI3K/AKT/GSK3β,ERK1/2,JNK/STAT3,PKC,KATP channels等。這些現(xiàn)象提示我們可能存在同時受這兩種方法調(diào)控的心肌保護靶點。近期的研究表明,膜蛋白syntaxin-1A可能就是其中之一。本課題擬研究syntaxin-1A在心肌缺血再灌注損傷中的作用,并探索新型缺血再灌注損傷的治療手段。第一部分Syntaxin-1A介導(dǎo)了異氟烷預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用目的:Syntaxin-1A廣泛的分布在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心臟和其他各組織器官。研究發(fā)現(xiàn),syntaxin-1A能夠調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的信號通路,如KATP通道和鈣離子通道的開放。Syntaxin-1A在組織缺血時表達上調(diào)。這些結(jié)果提示syntaxin-1A在心肌缺血再灌注損傷中的作用。更重要的是,研究發(fā)現(xiàn)吸入性全麻要異氟烷和氟烷能夠與膜蛋白syntaxin-1A結(jié)合。本研究假設(shè)一:缺血再灌注損傷、缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理能夠調(diào)控心肌syntaxin-1A表達水平。假設(shè)二:心肌細(xì)胞syntaxin-1A表達水平變化能夠影響缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理產(chǎn)生的心肌缺血再灌注保護作用。假設(shè)三:syntaxin-1A通過調(diào)節(jié)上述PI3K/AKT/GSK3β,ERK1/2,JNK/STAT3,PKC信號通路的活化來發(fā)揮保護作用。方法:實驗分為五組:SHAM(對照組);Iso(異氟烷組,1.5%);IR(缺血再灌注組);IPC(缺血預(yù)處理組);Iso-PC(異氟烷預(yù)處理組)。并利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染干擾或過表達原代心肌細(xì)胞中syntaxin-1A的表達水平。實驗一:通過SD大鼠在體心肌缺血再灌注模型和原代細(xì)胞離題缺氧復(fù)氧模型的建立,利用Western blot觀察再灌注4小時和24小時后syntaxin-1A在各處理組中表達水平的變化,并檢測心肌損傷指標(biāo),包括血清肌鈣蛋白c Tn T,細(xì)胞活力,和細(xì)胞凋亡率。實驗二:利用大鼠原代心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧模型,通過重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)或下調(diào)syntaxin-1A的表達水平,觀察各實驗組原代細(xì)胞缺氧損傷的變化。采用MTT法檢測心肌細(xì)胞活力;采用流式細(xì)胞儀Annexin V-APC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率。實驗三:Syntaxin-1A保護心肌缺血再灌注損傷的通路機制研究。采用western blot技術(shù)檢測上調(diào)或下調(diào)syntaxin-1A表達水平后,心肌保護性信號通路的活化情況,包括ERK1/2、AKT、GSK3β和STAT3磷酸化活化程度;PKC蛋白表達水平。結(jié)果:實驗一:在體和細(xì)胞模型實驗同時表明,缺血再灌注損傷能使心肌syntaxin-1A表達上調(diào),而缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理能使syntaxin-1A的表達進一步上升。實驗二:利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控syntaxin-1A的表達水平能夠影響缺氧復(fù)氧損傷誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力;同時,利用si RNA技術(shù)降低syntaxin-1A的表達能夠阻斷異氟烷預(yù)處理產(chǎn)生的心臟保護效應(yīng),但對缺血預(yù)處理的作用影響不大。實驗三:缺血再灌注損傷能上調(diào)ERK1/2,STAT3,AKT和GSK3β的磷酸化水平以及PKC的表達水平;同時,syntaxin-1A表達下調(diào)后能明顯激活PI3K/AKT/GSK3β信號通路,但上調(diào)其表達對PI3K/AKT/GSK3β信號通路影響不大。結(jié)論:Syntaxin-1A能夠?qū)π募∪毖俟嘧p傷產(chǎn)生保護作用,并且可能是異氟烷預(yù)處理發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷保護作用的的靶蛋白。Syntaxin-1A的表達調(diào)控與PI3K/AKT/GSK3β信號通路的活化相關(guān)。第二部分二次缺氧損傷保護性藥物的高通量篩選目的:在缺血損傷發(fā)生后,兩種完全不同的病理生理學(xué)過程造成了組織細(xì)胞的死亡。細(xì)胞自發(fā)的死亡機制在前期已經(jīng)得到很好的研究和闡述,包括細(xì)胞的壞死和凋亡等。另一方面,缺血后已經(jīng)死亡的細(xì)胞可以釋放小分子來促進周圍細(xì)胞的死亡。鉀離子和谷氨酸被證明從缺氧損傷的神經(jīng)元釋放并誘發(fā)周圍神經(jīng)元的死亡。這種缺氧損傷后細(xì)胞的非自發(fā)性死亡被稱為“二次缺氧損傷”。這種現(xiàn)象在臨床上被認(rèn)為更加重要,因為這些細(xì)胞遭受缺氧損傷指出仍然是存活的,例如腦卒中的“半影區(qū)(Penumbra)”和心梗中的危險區(qū)域(Area at Risk,AAR)。目前在臨床上圍術(shù)期缺血再灌注損傷發(fā)生后,仍缺乏有效的治療措施。前瞻性藥物篩選方法能夠為發(fā)現(xiàn)未知藥物和藥物的未知功能提供可能性。本實驗擬進一步實驗一:構(gòu)建針對二次缺氧損傷保護性藥物的高通量篩選模型。實驗二:利用構(gòu)建的高通量篩選模型篩選具有二次缺氧損傷保護作用的潛在藥物。方法:研究采用了秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,C.elegans)突變型蟲系gc47:gc Is3作為動物模型。該蟲系具有rars-1(gc47)突變背景,但咽部表達野生型基因。該突變型gc47是位于秀麗隱桿線蟲3號染色體左臂上編碼rrt-1基因的第811核苷酸甘氨酸殘基(G)突變?yōu)楸彼釟埢?A),使精氨酸-t RNA合成酶的功能降低,從而蛋白合成效率降低。突變型gc47對缺氧有出色的耐受性,而gc47:gc Is3蟲系在缺氧損傷后的4-6天里逐漸受損乃至死亡。本部分實驗一:利用秀麗隱桿線蟲突變型蟲系gc47:gc Is3構(gòu)建二次缺氧損傷高通量篩選的實驗?zāi)Ｐ�。實驗�?選取Microsource Discovery System公司的Spectrum Collection化合物庫,包含2000種不同的藥物,其中包括1000種臨床藥物,580種自然提取物和420種具有生物活性的化合物。利用已構(gòu)建的高通量篩選模型,尋找對二次缺氧損傷具有保護作用的潛在藥物。結(jié)果:實驗一:通過實驗,構(gòu)建了一套以突變型gc47:gc Is3蟲系為實驗對象的高通量藥物篩選模型。缺氧時間27小時為最佳實驗時間;缺氧后96小時后為評價時間節(jié)點;評價指標(biāo)包括線蟲的形態(tài)、運動、大小等;并通過小型篩選實驗成功篩選出陽性對照藥物多西環(huán)素。實驗二:經(jīng)過第一輪篩選,從2000種藥物中得到125種具有潛在保護作用的藥物;從中選取80種藥物,建立濃度梯度,進行第二次篩選,得到16種保護藥物;第三輪篩選采用常規(guī)缺氧損傷實驗方法,經(jīng)過反復(fù)驗證,最終明確2種具有二次損傷保護作用的新型藥物。結(jié)論:本實驗構(gòu)建的高通量藥物篩選模型能成功地篩選出對二次缺氧損傷有保護作用的陽性藥物。甲氯環(huán)素、非那吡啶是潛在的治療二次缺氧損傷的藥物。新藥物的發(fā)現(xiàn),將為臨床圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注損傷 異氟烷 Syntaxin-1A 二次缺氧損傷 高通量篩選
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 第一部分 Syntaxin-1A參與了異氟烷對心肌缺血再灌注損傷的保護作用13-35
• 一、前言13-15
• 二、材料和方法15-23
• 三、結(jié)果23-32
• 四、討論32-35
• 第二部分 二次缺氧損傷保護性藥物的高通量篩選35-55
• 一、前言35-37
• 二、材料與方法37-44
• 三、結(jié)果44-51
• 四、討論51-55
• 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻56-65
• 綜述一65-74
• 參考文獻69-74
• 綜述二74-103
• References98-103
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況103-104
• 致謝104

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1 劉猛;心肌缺血再灌注損傷中Syntaxin-1A的作用及保護性藥物篩選[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷中Syntaxin-1A的作用及保護性藥物篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：406841