本文關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷中Syntaxin-1A的作用及保護(hù)性藥物篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:圍術(shù)期心臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)發(fā)生率高,在非心臟手術(shù)中的發(fā)生率也達(dá)到1%-4%,而且預(yù)后不良,增加了住院病人的發(fā)病率和死亡率。多種方法和藥物,包括缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning,IPC)和腺苷(adenosine)等,都用于減少圍術(shù)期心肌缺血再灌注的發(fā)生以改善病人的預(yù)后。除此之外,吸入性全麻藥如異氟烷和七氟烷也具備心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。然而吸入性全麻藥和缺血預(yù)處理的作用機(jī)制仍不清楚,而且對(duì)于臨床圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷仍缺乏有效的治療手段。吸入性全麻藥和缺血預(yù)處理通過相似的細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮作用,例如PI3K/AKT/GSK3β,ERK1/2,JNK/STAT3,PKC,KATP channels等。這些現(xiàn)象提示我們可能存在同時(shí)受這兩種方法調(diào)控的心肌保護(hù)靶點(diǎn)。近期的研究表明,膜蛋白syntaxin-1A可能就是其中之一。本課題擬研究syntaxin-1A在心肌缺血再灌注損傷中的作用,并探索新型缺血再灌注損傷的治療手段。第一部分Syntaxin-1A介導(dǎo)了異氟烷預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用目的:Syntaxin-1A廣泛的分布在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、心臟和其他各組織器官。研究發(fā)現(xiàn),syntaxin-1A能夠調(diào)節(jié)心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的信號(hào)通路,如KATP通道和鈣離子通道的開放。Syntaxin-1A在組織缺血時(shí)表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果提示syntaxin-1A在心肌缺血再灌注損傷中的作用。更重要的是,研究發(fā)現(xiàn)吸入性全麻要異氟烷和氟烷能夠與膜蛋白syntaxin-1A結(jié)合。本研究假設(shè)一:缺血再灌注損傷、缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理能夠調(diào)控心肌syntaxin-1A表達(dá)水平。假設(shè)二:心肌細(xì)胞syntaxin-1A表達(dá)水平變化能夠影響缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理產(chǎn)生的心肌缺血再灌注保護(hù)作用。假設(shè)三:syntaxin-1A通過調(diào)節(jié)上述PI3K/AKT/GSK3β,ERK1/2,JNK/STAT3,PKC信號(hào)通路的活化來發(fā)揮保護(hù)作用。方法:實(shí)驗(yàn)分為五組:SHAM(對(duì)照組);Iso(異氟烷組,1.5%);IR(缺血再灌注組);IPC(缺血預(yù)處理組);Iso-PC(異氟烷預(yù)處理組)。并利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染干擾或過表達(dá)原代心肌細(xì)胞中syntaxin-1A的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)一:通過SD大鼠在體心肌缺血再灌注模型和原代細(xì)胞離題缺氧復(fù)氧模型的建立,利用Western blot觀察再灌注4小時(shí)和24小時(shí)后syntaxin-1A在各處理組中表達(dá)水平的變化,并檢測心肌損傷指標(biāo),包括血清肌鈣蛋白c Tn T,細(xì)胞活力,和細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)二:利用大鼠原代心肌細(xì)胞的缺氧復(fù)氧模型,通過重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)或下調(diào)syntaxin-1A的表達(dá)水平,觀察各實(shí)驗(yàn)組原代細(xì)胞缺氧損傷的變化。采用MTT法檢測心肌細(xì)胞活力;采用流式細(xì)胞儀Annexin V-APC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)三:Syntaxin-1A保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的通路機(jī)制研究。采用western blot技術(shù)檢測上調(diào)或下調(diào)syntaxin-1A表達(dá)水平后,心肌保護(hù)性信號(hào)通路的活化情況,包括ERK1/2、AKT、GSK3β和STAT3磷酸化活化程度;PKC蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:在體和細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明,缺血再灌注損傷能使心肌syntaxin-1A表達(dá)上調(diào),而缺血預(yù)處理和異氟烷預(yù)處理能使syntaxin-1A的表達(dá)進(jìn)一步上升。實(shí)驗(yàn)二:利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控syntaxin-1A的表達(dá)水平能夠影響缺氧復(fù)氧損傷誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力;同時(shí),利用si RNA技術(shù)降低syntaxin-1A的表達(dá)能夠阻斷異氟烷預(yù)處理產(chǎn)生的心臟保護(hù)效應(yīng),但對(duì)缺血預(yù)處理的作用影響不大。實(shí)驗(yàn)三:缺血再灌注損傷能上調(diào)ERK1/2,STAT3,AKT和GSK3β的磷酸化水平以及PKC的表達(dá)水平;同時(shí),syntaxin-1A表達(dá)下調(diào)后能明顯激活PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路,但上調(diào)其表達(dá)對(duì)PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路影響不大。結(jié)論:Syntaxin-1A能夠?qū)π募∪毖俟嘧p傷產(chǎn)生保護(hù)作用,并且可能是異氟烷預(yù)處理發(fā)揮心肌缺血再灌注損傷保護(hù)作用的的靶蛋白。Syntaxin-1A的表達(dá)調(diào)控與PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路的活化相關(guān)。第二部分二次缺氧損傷保護(hù)性藥物的高通量篩選目的:在缺血損傷發(fā)生后,兩種完全不同的病理生理學(xué)過程造成了組織細(xì)胞的死亡。細(xì)胞自發(fā)的死亡機(jī)制在前期已經(jīng)得到很好的研究和闡述,包括細(xì)胞的壞死和凋亡等。另一方面,缺血后已經(jīng)死亡的細(xì)胞可以釋放小分子來促進(jìn)周圍細(xì)胞的死亡。鉀離子和谷氨酸被證明從缺氧損傷的神經(jīng)元釋放并誘發(fā)周圍神經(jīng)元的死亡。這種缺氧損傷后細(xì)胞的非自發(fā)性死亡被稱為“二次缺氧損傷”。這種現(xiàn)象在臨床上被認(rèn)為更加重要,因?yàn)檫@些細(xì)胞遭受缺氧損傷指出仍然是存活的,例如腦卒中的“半影區(qū)(Penumbra)”和心梗中的危險(xiǎn)區(qū)域(Area at Risk,AAR)。目前在臨床上圍術(shù)期缺血再灌注損傷發(fā)生后,仍缺乏有效的治療措施。前瞻性藥物篩選方法能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)未知藥物和藥物的未知功能提供可能性。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)一:構(gòu)建針對(duì)二次缺氧損傷保護(hù)性藥物的高通量篩選模型。實(shí)驗(yàn)二:利用構(gòu)建的高通量篩選模型篩選具有二次缺氧損傷保護(hù)作用的潛在藥物。方法:研究采用了秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,C.elegans)突變型蟲系gc47:gc Is3作為動(dòng)物模型。該蟲系具有rars-1(gc47)突變背景,但咽部表達(dá)野生型基因。該突變型gc47是位于秀麗隱桿線蟲3號(hào)染色體左臂上編碼rrt-1基因的第811核苷酸甘氨酸殘基(G)突變?yōu)楸彼釟埢?A),使精氨酸-t RNA合成酶的功能降低,從而蛋白合成效率降低。突變型gc47對(duì)缺氧有出色的耐受性,而gc47:gc Is3蟲系在缺氧損傷后的4-6天里逐漸受損乃至死亡。本部分實(shí)驗(yàn)一:利用秀麗隱桿線蟲突變型蟲系gc47:gc Is3構(gòu)建二次缺氧損傷高通量篩選的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。�?shí)驗(yàn)二:選取Microsource Discovery System公司的Spectrum Collection化合物庫,包含2000種不同的藥物,其中包括1000種臨床藥物,580種自然提取物和420種具有生物活性的化合物。利用已構(gòu)建的高通量篩選模型,尋找對(duì)二次缺氧損傷具有保護(hù)作用的潛在藥物。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:通過實(shí)驗(yàn),構(gòu)建了一套以突變型gc47:gc Is3蟲系為實(shí)驗(yàn)對(duì)象的高通量藥物篩選模型。缺氧時(shí)間27小時(shí)為最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間;缺氧后96小時(shí)后為評(píng)價(jià)時(shí)間節(jié)點(diǎn);評(píng)價(jià)指標(biāo)包括線蟲的形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、大小等;并通過小型篩選實(shí)驗(yàn)成功篩選出陽性對(duì)照藥物多西環(huán)素。實(shí)驗(yàn)二:經(jīng)過第一輪篩選,從2000種藥物中得到125種具有潛在保護(hù)作用的藥物;從中選取80種藥物,建立濃度梯度,進(jìn)行第二次篩選,得到16種保護(hù)藥物;第三輪篩選采用常規(guī)缺氧損傷實(shí)驗(yàn)方法,經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證,最終明確2種具有二次損傷保護(hù)作用的新型藥物。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的高通量藥物篩選模型能成功地篩選出對(duì)二次缺氧損傷有保護(hù)作用的陽性藥物。甲氯環(huán)素、非那吡啶是潛在的治療二次缺氧損傷的藥物。新藥物的發(fā)現(xiàn),將為臨床圍術(shù)期心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注損傷 異氟烷 Syntaxin-1A 二次缺氧損傷 高通量篩選
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 縮略詞表11-13
• 第一部分 Syntaxin-1A參與了異氟烷對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用13-35
• 一、前言13-15
• 二、材料和方法15-23
• 三、結(jié)果23-32
• 四、討論32-35
• 第二部分 二次缺氧損傷保護(hù)性藥物的高通量篩選35-55
• 一、前言35-37
• 二、材料與方法37-44
• 三、結(jié)果44-51
• 四、討論51-55
• 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-65
• 綜述一65-74
• 參考文獻(xiàn)69-74
• 綜述二74-103
• References98-103
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況103-104
• 致謝104

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉猛;心肌缺血再灌注損傷中Syntaxin-1A的作用及保護(hù)性藥物篩選[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷中Syntaxin-1A的作用及保護(hù)性藥物篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：406841