利用活性的小分子化合物為探針發(fā)現重要的藥物作用靶標,并解釋細胞生命活動的規(guī)律是現代醫(yī)學研究中有效策略。我們研究發(fā)現藤黃酸(gambogic acid,GA)在體內外均能夠有效地抑制多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)細胞的存活與增殖。同時我們合成生物素標記GA(Biotin-GA)作為探針,利用一系列化學蛋白質組學技術開展其抗MM的化學生物學研究,研究結果發(fā)現GA可以直接靶向泛素特異性蛋白酶2a(USP2a)并高效抑制其酶活。接下來通過質譜分析與位點突變實驗證實了USP2a的Cys284是GA的共價結合位點。此外,研究發(fā)現USP2a在MM中高表達且與生存期顯著負相關,在MM細胞中敲低USP2a可顯著抑制其體內外增殖。綜上所述,我們的研究表明GA主要是通過別構抑制USP2a酶活發(fā)揮體內體外抗MM的效應,GA與USP2a作用的Cys284結合口袋有望為開發(fā)特異高效USP2a的抑制劑提供參考。T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)是由于未成熟T細胞祖細胞的致癌轉化而引起的一種淋巴樣惡性腫瘤,預后較差,急需新靶標的識別與發(fā)展新的藥物來治療這種疾病。WP1130是一種去泛素蛋白...

【文章頁數】：120 頁

【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
全文主要縮略語中英文對照表
第一部分 靶向USP2a抑制多發(fā)性骨髓瘤化學生物學研究
    第一章:研究背景和問題的提出
        1.1 USP2的分類、定位及結構
            1.1.1 USP2 的分類與定位
            1.1.2 USP2 蛋白結構
        1.2 USP2 與疾病
            1.2.1 USP2 與腫瘤
            1.2.2 USP2 與炎癥
            1.2.3 USP2 與其他
        1.3 USP2 抑制劑研究現狀
        1.4 本文主要研究內容概述
    第二章:GA在體內體外均可抑制MM
        2.1 材料與方法
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 實驗動物
            2.1.4 細胞培養(yǎng)
            2.1.5 瑞氏染色
            2.1.6 裸鼠移植瘤模型的建立
            2.1.7 分組、給藥方式及觀察指標
            2.1.8 免疫組化檢測
        2.2 結果
            2.2.1 GA體外抑制MM效應
            2.2.2 GA體內抑制MM移植瘤效應
        2.3 小結與討論
    第三章:GA直接靶向USP2a
        3.1 材料與方法
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器
            3.1.3 Pull-down實驗驗證GA與 USP2a體外相互作用
            3.1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)
            3.1.5 GST-UBA52 蛋白的純化
            3.1.6 USP2a蛋白鎳柱純化
            3.1.7 細胞熱力學穩(wěn)定性遷移分析實驗(Cellular thermal shift assay, CETSA)
            3.1.8 GA與 USP2a的親和力常數(Kd)檢測
            3.1.9 應用GST-UBA52 為底物篩選對USP2a的化合物
            3.1.10 細胞免疫熒光
        3.2 結果
            3.2.1 利用Biotin-GA Pull-down實驗驗證與USP2a直接作用
            3.2.2 GA與 USP2a可在體外相互作用
            3.2.3 GA可高效、選擇性抑制USP2a酶活
            3.2.4 GA細胞內靶向USP2a
        3.3 小結與討論
    第四章:GA共價結合USP2a284 位半胱氨酸
        4.1 材料與方法
            4.1.1 USP2a與 GA的動力學結合常數
            4.1.2 USP2a蛋白分子篩純化
            4.1.3 USP2a過 SP離子交換柱
            4.1.4 USP2a質粒定點突變
            4.1.5 結合口袋氨基酸位點突變
            4.1.6 突變體的蛋白純化與親和力測試
            4.1.7 USP2a晶體篩選
        4.2 結果
            4.2.1 GA共價結合到USP2a蛋白的Cys284 位點
            4.2.2 USP2a與 GA結合的動力學特點
            4.2.3 Cys284 口袋預測
            4.2.4 USP2a晶體篩選優(yōu)化
        4.3 小結與討論
    第五章:USP2a在 MM中作用
        5.1 材料與方法
            5.1.1 主要試劑
            5.1.2 主要儀器
            5.1.3 構建帶有USP2 基因sgRNA和 Cas9 基因的表達質粒
            5.1.4 單克隆挑取
            5.1.5 質粒大量抽提
        5.2 結果
            5.2.1 USP2a在 MM中高表達且與生存期負相關
            5.2.2 敲除USP2a抑制MM體外增殖
            5.2.3 敲低USP2a后抑制MM體內移植瘤增殖
        5.3 討論
    第六章:結語
第二部分 WP1130 靶向USP24 抑制T-ALL的機制研究
    第一章 研究背景和問題的提出
        1.1 T-ALL的研究進展
        1.2 USP24 研究進展
        1.3 本文主要研究內容概述
    第二章 WP1130對T-ALL體外生物學效應研究
        2.1 材料與方法
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 CCK-8 檢測細胞增殖
            2.1.4 骨髓標本單個核細胞分離
            2.1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡
            2.1.6 Western blotting(蛋白印跡)
            2.1.7 統(tǒng)計學分析
        2.2 結果
            2.2.1 WP1130 抑制T-ALL細胞增殖
            2.2.2 WP1130 誘導T-ALL細胞凋亡
        2.3 小結與討論
    第三章 USP24在T-ALL中作用研究
        3.1 材料與方法
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器
            3.1.3 USP24與USP9X細胞敲除實驗
            3.1.4 熒光定量PCR
        3.2 結果
            3.2.1 敲低USP24 而不是USP9X可使T-ALL細胞凋亡
            3.2.2 敲低USP9X可使USP24 表達上調
            3.2.3 USP24在T-ALL中高表達并且與預后負相關
        3.3 小結與討論
    第四章 WP1130 可在T-ALL細胞內與USP24 相互作用
        4.1 材料與方法
            4.1.1 主要試劑
            4.1.2 主要儀器
            4.1.3 分子對接
            4.1.4 細胞熱力學穩(wěn)定性遷移分析實驗(CETSA)
        4.2 結果
            4.2.1 WP1130 可共價結合于USP24 活性中心
            4.2.2 WP1130 可改變USP24 的熱穩(wěn)定性
        4.3 小結與討論
    第五章 WP1130 通過USP24-Mcl-1 通路發(fā)揮作用
        5.1 材料和方法
            5.1.1 主要試劑
            5.1.2 主要儀器
            5.1.3 細胞線粒體跨膜電位檢測
            5.1.4 dCas9-sgUSP24質粒構建
        5.2 結果
            5.2.1 WP1130 下調Mcl-1 并且引起線粒體跨膜電位損傷
            5.2.2 WP1130 通過USP24-Mcl-1 通路引起細胞凋亡
        5.3 小結與討論
    第六章 WP1130 抑制T-ALL體內實驗
        6.1 材料與方法
            6.1.1 主要試劑
            6.1.2 體內動物實驗
        6.2 結果
            6.2.1 NOD-SCID小鼠一般情況
            6.2.2 移植瘤生長情況
            6.2.3 移植瘤免疫組化
    第七章 討論
參考文獻
致謝
學術論文和科研成果目錄
附錄:在"Cancer Cell International”發(fā)表論文



本文編號：3952249