利用活性的小分子化合物為探針發(fā)現(xiàn)重要的藥物作用靶標(biāo),并解釋細(xì)胞生命活動的規(guī)律是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中有效策略。我們研究發(fā)現(xiàn)藤黃酸(gambogic acid,GA)在體內(nèi)外均能夠有效地抑制多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)細(xì)胞的存活與增殖。同時我們合成生物素標(biāo)記GA(Biotin-GA)作為探針,利用一系列化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展其抗MM的化學(xué)生物學(xué)研究,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA可以直接靶向泛素特異性蛋白酶2a(USP2a)并高效抑制其酶活。接下來通過質(zhì)譜分析與位點突變實驗證實了USP2a的Cys284是GA的共價結(jié)合位點。此外,研究發(fā)現(xiàn)USP2a在MM中高表達(dá)且與生存期顯著負(fù)相關(guān),在MM細(xì)胞中敲低USP2a可顯著抑制其體內(nèi)外增殖。綜上所述,我們的研究表明GA主要是通過別構(gòu)抑制USP2a酶活發(fā)揮體內(nèi)體外抗MM的效應(yīng),GA與USP2a作用的Cys284結(jié)合口袋有望為開發(fā)特異高效USP2a的抑制劑提供參考。T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)是由于未成熟T細(xì)胞祖細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)化而引起的一種淋巴樣惡性腫瘤,預(yù)后較差,急需新靶標(biāo)的識別與發(fā)展新的藥物來治療這種疾病。WP1130是一種去泛素蛋白...

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【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
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第一部分 靶向USP2a抑制多發(fā)性骨髓瘤化學(xué)生物學(xué)研究
    第一章:研究背景和問題的提出
        1.1 USP2的分類、定位及結(jié)構(gòu)
            1.1.1 USP2 的分類與定位
            1.1.2 USP2 蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2 USP2 與疾病
            1.2.1 USP2 與腫瘤
            1.2.2 USP2 與炎癥
            1.2.3 USP2 與其他
        1.3 USP2 抑制劑研究現(xiàn)狀
        1.4 本文主要研究內(nèi)容概述
    第二章:GA在體內(nèi)體外均可抑制MM
        2.1 材料與方法
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 實驗動物
            2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)
            2.1.5 瑞氏染色
            2.1.6 裸鼠移植瘤模型的建立
            2.1.7 分組、給藥方式及觀察指標(biāo)
            2.1.8 免疫組化檢測
        2.2 結(jié)果
            2.2.1 GA體外抑制MM效應(yīng)
            2.2.2 GA體內(nèi)抑制MM移植瘤效應(yīng)
        2.3 小結(jié)與討論
    第三章:GA直接靶向USP2a
        3.1 材料與方法
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器
            3.1.3 Pull-down實驗驗證GA與 USP2a體外相互作用
            3.1.4 蛋白免疫印跡(Western blot)
            3.1.5 GST-UBA52 蛋白的純化
            3.1.6 USP2a蛋白鎳柱純化
            3.1.7 細(xì)胞熱力學(xué)穩(wěn)定性遷移分析實驗(Cellular thermal shift assay, CETSA)
            3.1.8 GA與 USP2a的親和力常數(shù)(Kd)檢測
            3.1.9 應(yīng)用GST-UBA52 為底物篩選對USP2a的化合物
            3.1.10 細(xì)胞免疫熒光
        3.2 結(jié)果
            3.2.1 利用Biotin-GA Pull-down實驗驗證與USP2a直接作用
            3.2.2 GA與 USP2a可在體外相互作用
            3.2.3 GA可高效、選擇性抑制USP2a酶活
            3.2.4 GA細(xì)胞內(nèi)靶向USP2a
        3.3 小結(jié)與討論
    第四章:GA共價結(jié)合USP2a284 位半胱氨酸
        4.1 材料與方法
            4.1.1 USP2a與 GA的動力學(xué)結(jié)合常數(shù)
            4.1.2 USP2a蛋白分子篩純化
            4.1.3 USP2a過 SP離子交換柱
            4.1.4 USP2a質(zhì)粒定點突變
            4.1.5 結(jié)合口袋氨基酸位點突變
            4.1.6 突變體的蛋白純化與親和力測試
            4.1.7 USP2a晶體篩選
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 GA共價結(jié)合到USP2a蛋白的Cys284 位點
            4.2.2 USP2a與 GA結(jié)合的動力學(xué)特點
            4.2.3 Cys284 口袋預(yù)測
            4.2.4 USP2a晶體篩選優(yōu)化
        4.3 小結(jié)與討論
    第五章:USP2a在 MM中作用
        5.1 材料與方法
            5.1.1 主要試劑
            5.1.2 主要儀器
            5.1.3 構(gòu)建帶有USP2 基因sgRNA和 Cas9 基因的表達(dá)質(zhì)粒
            5.1.4 單克隆挑取
            5.1.5 質(zhì)粒大量抽提
        5.2 結(jié)果
            5.2.1 USP2a在 MM中高表達(dá)且與生存期負(fù)相關(guān)
            5.2.2 敲除USP2a抑制MM體外增殖
            5.2.3 敲低USP2a后抑制MM體內(nèi)移植瘤增殖
        5.3 討論
    第六章:結(jié)語
第二部分 WP1130 靶向USP24 抑制T-ALL的機(jī)制研究
    第一章 研究背景和問題的提出
        1.1 T-ALL的研究進(jìn)展
        1.2 USP24 研究進(jìn)展
        1.3 本文主要研究內(nèi)容概述
    第二章 WP1130對T-ALL體外生物學(xué)效應(yīng)研究
        2.1 材料與方法
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
            2.1.3 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖
            2.1.4 骨髓標(biāo)本單個核細(xì)胞分離
            2.1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡
            2.1.6 Western blotting(蛋白印跡)
            2.1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
        2.2 結(jié)果
            2.2.1 WP1130 抑制T-ALL細(xì)胞增殖
            2.2.2 WP1130 誘導(dǎo)T-ALL細(xì)胞凋亡
        2.3 小結(jié)與討論
    第三章 USP24在T-ALL中作用研究
        3.1 材料與方法
            3.1.1 主要試劑
            3.1.2 主要儀器
            3.1.3 USP24與USP9X細(xì)胞敲除實驗
            3.1.4 熒光定量PCR
        3.2 結(jié)果
            3.2.1 敲低USP24 而不是USP9X可使T-ALL細(xì)胞凋亡
            3.2.2 敲低USP9X可使USP24 表達(dá)上調(diào)
            3.2.3 USP24在T-ALL中高表達(dá)并且與預(yù)后負(fù)相關(guān)
        3.3 小結(jié)與討論
    第四章 WP1130 可在T-ALL細(xì)胞內(nèi)與USP24 相互作用
        4.1 材料與方法
            4.1.1 主要試劑
            4.1.2 主要儀器
            4.1.3 分子對接
            4.1.4 細(xì)胞熱力學(xué)穩(wěn)定性遷移分析實驗(CETSA)
        4.2 結(jié)果
            4.2.1 WP1130 可共價結(jié)合于USP24 活性中心
            4.2.2 WP1130 可改變USP24 的熱穩(wěn)定性
        4.3 小結(jié)與討論
    第五章 WP1130 通過USP24-Mcl-1 通路發(fā)揮作用
        5.1 材料和方法
            5.1.1 主要試劑
            5.1.2 主要儀器
            5.1.3 細(xì)胞線粒體跨膜電位檢測
            5.1.4 dCas9-sgUSP24質(zhì)粒構(gòu)建
        5.2 結(jié)果
            5.2.1 WP1130 下調(diào)Mcl-1 并且引起線粒體跨膜電位損傷
            5.2.2 WP1130 通過USP24-Mcl-1 通路引起細(xì)胞凋亡
        5.3 小結(jié)與討論
    第六章 WP1130 抑制T-ALL體內(nèi)實驗
        6.1 材料與方法
            6.1.1 主要試劑
            6.1.2 體內(nèi)動物實驗
        6.2 結(jié)果
            6.2.1 NOD-SCID小鼠一般情況
            6.2.2 移植瘤生長情況
            6.2.3 移植瘤免疫組化
    第七章 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
學(xué)術(shù)論文和科研成果目錄
附錄:在"Cancer Cell International”發(fā)表論文



本文編號：3952249