目的:基因組不穩(wěn)定是腫瘤的特征之一。DNA損傷應(yīng)答（DDR）是預防基因組不穩(wěn)定性的主要機制,也是影響細胞對電離輻射（IR）和許多化療藥物敏感性的重要因素。闡明DDR通路所涉及的分子調(diào)控機制對于理解腫瘤發(fā)生和干預腫瘤治療具有重要意義。蛋白質(zhì)棕櫚�；鳛橐环N重要的蛋白翻譯后修飾形式,可調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運及蛋白之間的相互作用等過程。近年研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酰化在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,但是其在基因組穩(wěn)定性及DNA損傷修復機制中的功能尚不明確。Porcupine（PORCN）蛋白是膜結(jié)合的O-酰基轉(zhuǎn)移酶,通常存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。本論文研究重點是闡明細胞核內(nèi)的PORCN蛋白對DDR及腫瘤放射敏感性的調(diào)控機制。方法:為了探究細胞核內(nèi)PORCN在DDR中的作用,首先采用慢病毒載體的PORCN sh RNA建立PORCN敲低的穩(wěn)定細胞系。然后采用可以抵抗sh RNA敲低的PORCN-WT及PORCN-ΔNLS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞并建立PORCN突變的HT1080穩(wěn)定細胞系。通過克隆形成實驗檢測細胞的放射敏感性,MTS實驗檢測細胞的增殖能力,免疫熒光實驗檢測細胞核內(nèi)DNA損傷修復蛋白γ-H2AX的表達變化。通... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

PORCN缺失的細胞表現(xiàn)為放療敏感性增強

1.2.2 PORCN 缺失細胞基因組穩(wěn)定性降低。1.2.2.1 PORCN 缺失細胞電離輻射后 DNA 損傷修復尚未完成時進入有絲分裂期。一般認為細胞完成 DNA 損傷的修復后才進入有絲分裂期，以保證將準確無誤的遺傳信息傳遞給子代細胞，進而維持基因組的穩(wěn)定性。DNA 雙鏈斷裂（DSB）時可誘導組蛋白 H2AX 發(fā)生磷酸化形成 γ-H2AX，所形成的 γ-H2AX 灶點數(shù)與DSBs 的數(shù)目成線性相關(guān)關(guān)系，也就是說一個 γ-H2AX 灶點代表有一個 DSB 發(fā)生。目前 γ-H2AX 的熒光染色已經(jīng)作為檢測 DSBs 的重要方法。為了觀察有絲分裂期細胞的 DNA 損傷修復狀況，采用 PORCN-WT 細胞及 PORCN 缺失的細胞，給予細胞 6Gy 的照射劑量，并進行 γ-H2AX 免疫熒光染色觀察，由圖 2 所示，電離輻射 48h 后 PORCN-WT 細胞中未觀察到 γ-H2AX 灶點（紅色熒光小點）存在，而 PORCN 缺失的細胞在有絲分裂期仍然有 γ-H2AX 灶點存在，表明 PORCN 缺失的細胞在進行有絲分裂時 DNA 損傷修復尚未完成，增加了將錯誤遺傳信息傳遞到子細胞的風險。

天津醫(yī)科大學博士學位論文灶點代表 DNA 損傷情況。1.2.2.2 PORCN 缺失細胞電離輻射后微核化、多核化、異倍體出現(xiàn)的比率顯著增加。如果有絲分裂過程中，持續(xù)發(fā)生錯誤，將會導致染色體不穩(wěn)定。表現(xiàn)為微核化、多核化、異倍體出現(xiàn)的比率增加。本研究采用 PORCN-WT 細胞及 PORCN缺失的細胞鋪板，細胞貼壁后給予細胞 6Gy 的照射劑量，分別在照射后 0 小時，24 小時，48 小時，72 小時固定細胞，并進行姬姆薩染色，如圖 3A，B 所示，通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)與PORCN-WT細胞相比PORCN缺失的HT080細胞在電離輻射 24 小時后微核化、多核化、異倍體出現(xiàn)的比率顯著增加。


本文編號：3384484