本文關(guān)鍵詞：HCN通道在DO大鼠膀胱ICC細(xì)胞上的表達(dá)和電生理特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的:膀胱過度活動(dòng)癥(OAB)是由逼尿肌過度活動(dòng)(DO)導(dǎo)致的泌尿科常見疾病,臨床表現(xiàn)為尿頻、尿急和緊迫性的尿失禁,如不及時(shí)治療,會(huì)導(dǎo)致腎盂,輸尿管功能受損并會(huì)引起腎積水、最終導(dǎo)致腎功能損害,給患者生活帶來很多不便和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。OAB的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明,膀胱逼尿肌興奮性異常是導(dǎo)致的DO的直接原因,研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)疾病、膀胱出口梗阻和泌尿系統(tǒng)感染等均可引起DO。膀胱逼尿肌興奮性受自主神經(jīng)和體神經(jīng)的雙重支配,因此其興奮調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。目前,神經(jīng)源性和肌源性兩大學(xué)說為最主要的膀胱調(diào)控理論。但是,單一的神經(jīng)源性或者肌源性學(xué)說都不能完全解釋膀胱興奮調(diào)控機(jī)制,例如:神經(jīng)源性學(xué)說不能解釋膀胱離體逼尿肌條自發(fā)性收縮現(xiàn)象,肌源性學(xué)說不能解釋膀胱收縮“全/無”的現(xiàn)象,因此,找到這兩大學(xué)說關(guān)于膀胱興奮調(diào)控的功能通路,將有助于深入闡述膀胱的興奮調(diào)控和OAB發(fā)病機(jī)制。1996年,Smet等人首先發(fā)現(xiàn)在豚鼠和人的膀胱中存在和胃腸道ICC細(xì)胞類似的膀胱ICC細(xì)胞,其分布于膀胱粘膜下層和平滑肌肌束間。組織結(jié)構(gòu)上,膀胱ICC細(xì)胞與神經(jīng)和逼尿肌細(xì)胞間存在緊密的聯(lián)系。同時(shí)證實(shí)粘膜下ICC細(xì)胞與膽堿神經(jīng)叢緊密相連,并且在ICC細(xì)胞上面表達(dá)M2、M3膽堿能受體;電鏡顯示ICC細(xì)胞與膀胱逼尿肌細(xì)胞之間存在緊密的縫隙連接;這些都說明膀胱ICC細(xì)胞在膀胱興奮調(diào)控中的樞紐作用。其發(fā)現(xiàn)為我們找到神經(jīng)源性/肌源性這兩大學(xué)說關(guān)于膀胱興奮調(diào)控機(jī)制的共同通路提供了可能,研究膀胱ICC細(xì)胞的興奮傳導(dǎo)和調(diào)控機(jī)理,會(huì)有助于我們深入了解膀胱的興奮調(diào)控及OAB發(fā)病機(jī)理,為OAB的治療提供新的理論基礎(chǔ)和靶點(diǎn)。HCN(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide cation channel,HCN)通道是超極化激活環(huán)核苷酸門控的陽離子通道,其由6個(gè)跨膜片段(S1-S6)組成,位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分形成K+離子選擇性通道所特有的GYG標(biāo)志序列。HCN通道所介導(dǎo)的Ih電流被認(rèn)為是起搏細(xì)胞的重要特征,在包括心臟和大腦起搏活性的生理功能上發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)膀胱ICC細(xì)胞表達(dá)HCN1-4通道亞型,可產(chǎn)生hcn通道內(nèi)向超極化電流ih。hcn通道阻滯劑zd7288可降低膀胱icc細(xì)胞內(nèi)t型鈣通道電流,并可顯著降低膀胱逼尿肌收縮頻率和幅度。這說明hcn通道可調(diào)控鈣離子軸影響膀胱icc細(xì)胞興奮。因此hcn通道源性的icc細(xì)胞興奮調(diào)節(jié)在膀胱興奮調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在許多疾病狀態(tài)下,hcn通道的活化和生理特性會(huì)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)衰竭心臟的心室肌細(xì)胞中hcn通道活化增強(qiáng)。因此我們猜想do可能與膀胱icc細(xì)胞hcn通道的變化有關(guān)。研究do膀胱icc細(xì)胞中hcn通道的表達(dá)和電生理變化有利于闡明do的發(fā)病機(jī)制,并為治療do提供新的靶點(diǎn)。而do的發(fā)病原因以pboo性疾病最為多見,其中以bph最為多見。大量的研究表明,膀胱出口梗阻后膀胱icc細(xì)胞數(shù)量和生理功能的改變在pboo所致do的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。綜上所述,基于hcn源性的icc細(xì)胞興奮在膀胱興奮中的調(diào)控作用,本研究擬用pboo的方法來構(gòu)建do大鼠模型,并用假手術(shù)組大鼠做正常對(duì)照。通過分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法檢測hcn通道各亞型在膀胱icc細(xì)胞中的表達(dá)變化,用電生理學(xué)方法檢測hcn通道的電生理變化,并探討hcn通道對(duì)正常和do大鼠膀胱的收縮功能影響。方法:第一部分:do大鼠模型的建立和鑒定通過pboo的方法來建立do大鼠模型,行下腹部正中切口,對(duì)大鼠膀胱出口處進(jìn)行結(jié)扎模擬膀胱出口部分梗阻,術(shù)后縫合下腹部。假手術(shù)組大鼠只進(jìn)行切開并縫合,不做下尿道接扎。手術(shù)完成后8周行膀胱充盈性測壓實(shí)驗(yàn),觀察大鼠膀胱的排尿收縮是否正常。對(duì)于手術(shù)組大鼠,如果膀胱充盈性測壓實(shí)驗(yàn)顯示非正常的膀胱排尿收縮記為do模型大鼠;假手術(shù)組大鼠則記為正常對(duì)照組。第二部分:hcn通道在do大鼠膀胱icc細(xì)胞中的表達(dá)變化1.取正常對(duì)照組和do模型組大鼠膀胱,用rt-pcr的方法檢測hcn1-4通道亞型mrna在do膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)變化;2.取正常對(duì)照組和do模型組大鼠膀胱,用wb的方法檢測hcn1-4通道亞型蛋白在do膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)變化;3.取正常對(duì)照組和do模型組大鼠膀胱,用免疫熒光雙標(biāo)染色的方法檢測hcn1-4通道亞型在do膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)變化。第三部分:hcn通道在do大鼠膀胱icc細(xì)胞中的電生理變化及對(duì)膀胱收縮功能影響1.分離得到正常對(duì)照組和do模型組大鼠膀胱icc細(xì)胞,用膜片鉗的方法檢測hcn通道電流ih的密度和激活電壓變化情況;2.分離得到正常對(duì)照組和do模型組大鼠膀胱icc細(xì)胞,用活細(xì)胞工作站的方法檢測hcn通道特異性阻滯劑zd7288對(duì)兩組icc細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響;3.取正常對(duì)照組和do模型組大鼠膀胱進(jìn)行肌條實(shí)驗(yàn),觀察hcn通道特異性阻滯劑zd7288對(duì)兩組膀胱逼尿肌收縮功能的影響。結(jié)果:第一部分:do模型大鼠的建立和鑒定膀胱充盈性測壓實(shí)驗(yàn)顯示do組大鼠膀胱的排尿反射不是呈現(xiàn)充盈-排尿-充盈的膀胱排尿反射,而是出現(xiàn)非自主的過度活動(dòng)的膀胱排尿反射。證明pboo手術(shù)成功構(gòu)建do大鼠模型。第二部分:hcn通道在do模型大鼠膀胱icc細(xì)胞中的表達(dá)變化1.rt-pcr的結(jié)果顯示hcn1-4通道亞型mrna在do大鼠膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組有明顯增加;2.wb的結(jié)果顯示hcn1-4通道亞型蛋白在do大鼠膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組有明顯增加;3.免疫熒光雙標(biāo)的結(jié)果顯示hcn1-4通道亞型蛋白在do大鼠膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組有明顯增加。第三部分:hcn通道在do模型大鼠膀胱icc細(xì)胞中的電生理變化及對(duì)膀胱收縮功能影響1.膜片鉗的結(jié)果顯示do大鼠膀胱icc細(xì)胞上ih電流密度相比于對(duì)照組icc細(xì)胞明顯增加,并且ih電流的的最大半激活電壓v1/2也明顯降低;2.活細(xì)胞工作站的結(jié)果顯示10μmol/l的zd7288可以明顯抑制對(duì)照組icc細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,而同樣10μmol/l的zd7288卻不能抑制do組icc細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。當(dāng)zd7288的濃度上升到50μmol/l時(shí),對(duì)照和正常組icc細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度都會(huì)受到明顯抑制;3.膀胱逼尿肌條實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示10μmol/l的zd7288可以明顯抑制對(duì)照組逼尿肌條的收縮幅度,而同樣10μmol/l的zd7288卻不能抑制do組膀胱逼尿肌條的收縮幅度。當(dāng)zd7288的濃度上升到50μmol/l時(shí),do模型組和正常對(duì)照組逼尿肌條的收縮幅度都會(huì)受到明顯抑制。結(jié)論:本課題探索hcn通道在do模型大鼠膀胱icc細(xì)胞上的表達(dá)和電生理性質(zhì)變化:一、在PBOO所致DO模型大鼠膀胱ICC細(xì)胞中HCN通道m(xù)RNA和蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組有明顯升高。二、DO模型大鼠膀胱ICC細(xì)胞中Ih電流密度升高,并且隨著HCN通道的表達(dá)量升高會(huì)造成膀胱ICC細(xì)胞內(nèi)的鈣離子信號(hào)和膀胱收縮功能的增強(qiáng)。結(jié)果提示HCN通道可能參與DO的發(fā)病,為臨床DO的診治提供理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：膀胱 逼尿肌過度活動(dòng) ICC細(xì)胞 HCN通道 尿動(dòng)力學(xué)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R694.5
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-11
• 中文摘要11-15
• 第一章 前言15-18
• 第二章 DO模型大鼠的建立和鑒定18-24
• 2.1 材料和實(shí)驗(yàn)方法18-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-22
• 2.3 討論22-23
• 2.4 小結(jié)23-24
• 第三章 HCN通道在DO大鼠膀胱ICC細(xì)胞中的表達(dá)變化24-39
• 3.1 材料和實(shí)驗(yàn)方法24-34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-37
• 3.3 討論37-38
• 3.4 小結(jié)38-39
• 第四章 HCN通道在DO大鼠膀胱ICC細(xì)胞中的電生理變化及對(duì)膀胱收縮功能影響39-62
• 4.1 材料和實(shí)驗(yàn)方法39-53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-59
• 4.3 討論59-61
• 4.4 小結(jié)61-62
• 全文總結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 文獻(xiàn)綜述一 膀胱卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞的研究進(jìn)展71-87
• 參考文獻(xiàn)78-87
• 文獻(xiàn)綜述二 超極化激活電流和超極化激活環(huán)核苷酸門控通道的研究進(jìn)展87-108
• 參考文獻(xiàn)96-108
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文108-109
• 致謝109

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本文編號(hào)：328789