本文關(guān)鍵詞：Argonaute-2蛋白在肝癌血管生成和擬態(tài)中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝癌依然是世界范圍內(nèi)的頂尖癌癥殺手之一,高密度的血管形成不但是肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)誘因,而且還是肝癌組織營養(yǎng)供給的主要途徑。諸多關(guān)于血管生成的研究已經(jīng)證實,血管生成過程極其復(fù)雜但受到包括VEGF,PDGF,FGF,Endostatin等相關(guān)因子的嚴密調(diào)控。另外,近年來的研究也證實了miRNAs在血管生成中的重要作用。除此之外,腫瘤細胞自身形成擬態(tài)結(jié)構(gòu)也被證實和血管生成在轉(zhuǎn)移,血供等方面具有相輔相成的作用。盡管如此,對惡性腫瘤的血管生成和擬態(tài)過程相關(guān)調(diào)控機制的認識還有待進一步提高。作為miRNAs加工成熟和功能執(zhí)行的重要因子AGO2(Argonaute-2,又稱EIF2C2)蛋白,是AGO家族中唯一具有限制性酶切活性的成員,也是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)的必要催化組分,能通過多種作用機制參與非編碼小RNA(small non-coding RNA)誘導(dǎo)的特異性基因表達負調(diào)控過程。近年來也有研究表明,AGO2在多種惡性腫瘤組織中存在表達顯著上調(diào)現(xiàn)象,參與多種癌細胞相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),比如EGFR、AKT3、MAPK、FAK等,在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。已有報道稱,通過siRNA技術(shù)抑制HUVECs細胞中AGO2的表達,能有效抑制其新生血管生成過程,揭示出AGO2與血管生成兩者之間的直接聯(lián)系。而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)AGO2在肝癌組織中存在高表達的現(xiàn)象,干擾AGO2的表達對肝癌細胞的體外增殖沒有顯著影響,但對肝癌細胞的移植瘤體內(nèi)生長具有顯著的抑制作用。因此,在本研究中,我們利用siRNA干擾技術(shù)對肝癌細胞株Huh7和SMMC-7721中的Ago2基因進行干擾,在體內(nèi)外檢測Ago2基因干擾后對肝癌細胞的血管生成和擬態(tài)形成能力的影響,并進行多方面驗證。主要的方法與結(jié)果如下:一、Ago2基因的干擾對肝癌細胞血管形成體外研究采用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建Ago2基因干擾的Huh7,SMMC-7721和對照的細胞株(分別命名為Huh7/7721-ctrl/siAgo2),采用RT-PCR技術(shù)在mRNA水平檢測血管生成相關(guān)因子的表達情況,發(fā)現(xiàn)VEGF的表達受到顯著抑制。進一步采用Western Blot和ELISA技術(shù)在蛋白水平檢測AGO2和VEGF在六種肝癌細胞株中的表達相關(guān)性,驗證Ago2基因干擾對VEGF表達的影響,并采用與HUVECs細胞的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)檢驗Ago2基因干擾對肝癌細胞血管生成因子分-2-泌量的影響。實驗結(jié)果表明:ago2和vegf在肝癌細胞株中存在顯著的相關(guān)性,ago2基因的干擾在mrna和蛋白水平上均能顯著降低vegf的表達,并能有效削弱在共培養(yǎng)情況下肝癌細胞上清對huvecs細胞微管結(jié)構(gòu)形成的誘導(dǎo)能力。二、ago2基因的干擾對肝癌細胞血管生成影響的體內(nèi)研究將數(shù)量1×107的未干擾的對照細胞和ago2基因干擾的huh7/smmc-7721細胞分別皮下注射進行免疫缺陷型裸鼠移植,每組6只老鼠,注射后12天開始每4天測量一次腫瘤體積,測量三周后將所有老鼠脫頸處死,進行生長曲線分析,移植瘤體總質(zhì)量稱量和拍照,并將所有腫瘤組織浸泡于4%多聚甲醛中保存用于免疫組化檢測ago2,cd31和pten的表達情況。實驗結(jié)果表明:相比對照的細胞來源移植瘤,ago2基因干擾的肝癌細胞移植瘤生長、體積、重量以及ago2和cd31的表達均顯著下調(diào)。三、ago2與血管生成相互作用的機制研究前期研究顯示pten在ago2基因干擾的細胞中呈現(xiàn)上調(diào)表達現(xiàn)象,通過查閱文獻資料,我們發(fā)現(xiàn)pten已經(jīng)被普遍證實是著名的血管生成抑制因子。因此采用rt-pcr技術(shù)檢測ago2基因干擾后的肝癌細胞中pten的mrna表達水平,蛋白免疫印跡、免疫組織化學和免疫熒光技術(shù)檢測pten的體內(nèi)外蛋白表達水平,并采用不同濃度的pten特異性抑制劑bpv培養(yǎng)huh7/7721-siago2細胞后再對vegf表達及其上清誘導(dǎo)微管形成能力進行檢測。實驗結(jié)果表明:相比對照細胞,ago2基因干擾的肝癌細胞中pten的表達顯著上調(diào),當抑制pten的功能時,ago2與vegf的相互作用也明顯被阻斷。因此,pten是介導(dǎo)ago2與vegf相互作用的重要調(diào)控因子。四、ago2基因干擾對肝癌細胞擬態(tài)過程的影響研究將ago2基因干擾和對照的細胞種植到鋪好growthfactor-reducedmatrigel的3d培養(yǎng)六孔板中進行擬態(tài)形成過程體外驗證,深度測序揭示ago2基因干擾后引起一序列擬態(tài)相關(guān)重要因子的下調(diào),進一步采用rt-pcr,westernblot、免疫熒光和免疫組化技術(shù)對ago2、twist1、ve-cadherin、e-cadherin的表達進行檢測。實驗結(jié)果表明:ago2基因干擾對huh7、smmc-7721細胞的擬態(tài)過程具有顯著抑制作用,通過測序發(fā)現(xiàn)twist1的表達水平也因ago2基因的干擾受到顯著抑制,蛋白免疫印跡和免疫熒光進一步驗證了AGO2通過TWIST1調(diào)控肝癌細胞的擬態(tài)過程,而且TWIST1已經(jīng)被證實和肝癌細胞擬態(tài)具有正相關(guān)性。但AGO2與TWIST1在肝癌細胞株中不存在顯著的相關(guān)性,因此AGO2與TWIST1的相互作用機制有待進一步探索�？偠灾�,以上結(jié)果表明在肝癌細胞株中AGO2的表達與VEGF的表達存在緊密的相關(guān)性,干擾Ago2基因后引起VEGF和TWIST1表達下調(diào),從而阻礙移植瘤的血管生成和擬態(tài)形成過程,進一步影響腫瘤組織的生長。AGO2在肝癌患者組織中是否也存在上述作用有待進一步驗證,并試圖為肝癌的靶向治療提供新的線索和靶點。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 AGO2 Argonaute-2 血管生成 microRNAs 擬態(tài)
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-14
• 第一章 緒論14-24
• 一、AGO2蛋白結(jié)構(gòu)及功能信息14-15
• 二、AGO2的分子作用機制15-16
• 三、AGO2與癌癥的關(guān)系16-18
• 四、新近發(fā)現(xiàn)的AGO2與癌癥相關(guān)的信號通路18-19
• 五、AGO2與血管生成19
• 參考文獻19-24
• 第二章 AGO2在肝癌血管生成中的功能研究24-52
• (一) 材料與設(shè)備24-29
• (二) 方法及步驟29-39
• (三) 試驗結(jié)果及分析39-48
• 3.1 肝癌細胞株中AGO2與VEGF表達的相關(guān)性研究39-41
• 3.2 干擾Ago2對肝癌細胞的血管形成能力的體外研究41-44
• 3.3 干擾Ago2對肝癌細胞的血管形成能力的體內(nèi)研究44-46
• 3.4 干擾Ago2對肝癌細胞的血管形成能力的機制研究46-48
• (四) 結(jié)論與討論48-50
• 參考文獻50-52
• 第三章 AGO2在肝癌血管生成擬態(tài)中的功能研究52-67
• (一) 材料與設(shè)備52-55
• (二) 方法及步驟55-61
• (三) 試驗結(jié)果及分析61-65
• 3.1 Ago2基因的干擾抑制肝癌細胞的擬態(tài)過程61-63
• 3.2 Ago2基因的干擾引起肝癌細胞擬態(tài)過程受阻的機制探索 58(四) 結(jié)論與討論63-65
• (四) 結(jié)論與討論65
• 參考文獻65-67
• 文獻綜述一67-80
• 1. CIK細胞聯(lián)合DC治療69
• 2. CIK/DC-CIK聯(lián)合手術(shù)治療69-72
• 3. CIK/DC-CIK細胞聯(lián)合放化療72
• 4. CIK/DC-CIK聯(lián)合微創(chuàng)治療72-73
• 5. CIK/DC-CIK聯(lián)合其它治療73-74
• 結(jié)語74
• 參考文獻74-80
• 文獻綜述二80-96
• 1 Introduction80-81
• 2 Structural Information and Functional Molecular Mechanisms ofAGO281-84
• 3 AGO2 in Carcinomas84-89
• 4 Conclusion89
• Acknowledgments89
• References89-96
• 博士在讀期間發(fā)表論文情況96-97
• 致謝97

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 張菁超;李明鑫;;CIK治療肺癌的臨床觀察及相關(guān)因素分析[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2014年02期

2 尤振宇;蘇曉輝;劉洋;;DC-CIK生物治療輔助介入化療治療中心型非小細胞肺癌的臨床療效觀察[J];腫瘤藥學;2012年03期

3 曾金武;馮茜茜;;CIK細胞治療晚期非小細胞肺癌50例臨床觀察[J];臨床肺科雜志;2014年01期

  本文關(guān)鍵詞：Argonaute-2蛋白在肝癌血管生成和擬態(tài)中的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：326927