本文關(guān)鍵詞：miR-199靶向調(diào)控ROCK1影響腎癌細胞增殖、侵襲及凋亡的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景腎癌是泌尿系最常常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率約為全身惡性腫瘤的2%-3%,其中80%以上為源于腎近曲小管的腎透明細胞癌,并且以每年2%的速度遞增。目前腎癌的主要治療方式仍為手術(shù)切除,盡管近年來隨著疾病篩查的普及和監(jiān)測手段的先進化,早期小腎癌發(fā)現(xiàn)率越來越高,癥狀性腎癌的發(fā)生率逐漸減少,但臨床中仍有不少局部進展期腎癌的病例檢出,約20%～30%腎癌患者明確診斷時已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或靜脈內(nèi)癌栓形成。而轉(zhuǎn)移性腎癌會大大減低患者的生存率和治療效果；此外,即使患者進行了根治性手術(shù)切除,仍然有20%-30%患者術(shù)后3年內(nèi)會出現(xiàn)復發(fā)及轉(zhuǎn)移；再加上腎癌本身對傳統(tǒng)放療及化療并不敏感,從而使得手術(shù)無法切除的晚期腎癌患者治療較為困難,預后較差。因此,做到對腎癌患者的早期診斷及早期治療,具有重要的臨床意義。腎癌的早期發(fā)現(xiàn)及治療依賴于對其發(fā)生機制的詳細闡明。然而由于腎癌起因、發(fā)生及發(fā)展過程較為復雜,目前大量研究廣泛涉及到多種機制、多個基因及分子的共同參與,且對各個方面因素的具體作用和重要程度無從判別,現(xiàn)階段科學研究仍處于廣撒網(wǎng)、多點突破的階段,因此各個方面都被進行了研究。近年來,研究表明microRNA與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),且由于其突出的作用,越來越被大家所重視和深入研究。在腎癌中,也發(fā)現(xiàn)多個]niRNA表達的異常,包括miR-200c、miR-141、miR-200c等。同時,研究發(fā)現(xiàn)在腎癌細胞系中過表達miR-200c、miR-141可下調(diào)ZEB2蛋白表達,從而抑制腫瘤細胞的黏附和侵襲；低表達于腎癌組織的miR-34a,通過調(diào)控YY1抑制腎癌細胞的增殖和侵襲；miR-27a可下調(diào)FOXO1表達,進而促進腎癌細胞的增殖；miR-134通過靶向調(diào)節(jié)KRAS,起到抑制786-O腎透明細胞癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。同時,近年來研究也發(fā)現(xiàn)miR-199a低表達于腎癌組織,可能作為一個抑癌基因,參與腎癌的發(fā)生,但其作用機制及其生物學功能研究尚少,很多機制尚未完全闡明,仍具有較大的潛在研究價值。為此,我們開展了本研究。目的1.探討miR-199a在腎癌及癌旁相對正常組織中的表達,分析其表達與腎癌患者預后的關(guān)系；2.探討niR-199a在腎癌中的表達對細胞增殖、侵襲及凋亡的影響；3.探討miR-199a與其下游靶基因及上游調(diào)控基因的作用關(guān)系,闡明miR-199在腎癌中的作用機制；方法1.采用qRT-PCR定量檢測miR-199a在39例腎癌患者腫瘤組織及其癌旁相對正常腎組織中的表達量,并分析miR-199a在腎癌中的表達與患者預后的關(guān)系。2.采用慢病毒感染的方法,構(gòu)建穩(wěn)定過表達miR-199a的A498細胞株和空載對照組細胞株,并采用qRT-PCR進行驗證。3.采用MTT實驗、平板克隆實驗檢測腎癌細胞的增殖情況；應(yīng)用Transwell試驗檢測細胞的侵襲能力；利用流式細胞儀檢測腎癌細胞的凋亡情況。4.通過靶基因預測網(wǎng)站,結(jié)合生物信息學分析篩選miR-199a下游的候選靶基因,明確ROCK1可作為miR-199a的直接靶基因。通過構(gòu)建ROCK1突變體,將ROCK1與miR-199a共轉(zhuǎn)染腎癌A498細胞株,采用熒光素酶報告實驗檢測miR-199a對野生型及突變型ROCK1熒光素活性的影響,探討其作用關(guān)系。并采用MTT實驗、平板克隆實驗檢測ROCK1與miR-199a共轉(zhuǎn)染對腎癌細胞增殖能力的影響,采用流式細胞儀檢測ROCK1與miR-199a共轉(zhuǎn)染對腎癌細胞凋亡能力的影響。此外,通過qRT-PCR檢測ROCK1在39例腎癌組織中的表達,分析其表達與miR-199a表達的臨床相關(guān)性。5.通過分析miR-199a的DNA編碼序列,結(jié)合生物信息學分析,尋找其上游調(diào)控基因,發(fā)現(xiàn)在miR-199的DNA序列中有一個Snail轉(zhuǎn)錄子的結(jié)合位點,初步預判Snail為miR-199的上游調(diào)控基因。通過基因克隆,獲得miR-199a上游Snail啟動子結(jié)合位點,再將Snail啟動子結(jié)合位點及miR-199a共同轉(zhuǎn)染A498細胞株,通過熒光素酶報告實驗檢測Snail與miR-199的熒光素活性,并結(jié)合Northern blot實驗進一步驗證Snail與miR-199a之間的作用關(guān)系。同時,采用qRT-PCR檢測Snail在39例腎癌組織中的表達,分析其表達與miR-199a表達的臨床相關(guān)性。結(jié)果1. miR-199a在腎癌組織中的表達及其意義首先我們檢測了RNA提取的純度,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,可見28S、18S、5S三條清晰的帶型,未見DNA條帶,表明所抽提的RNA無降解、無DNA污染,相對較純,可用于逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)實驗。隨后,以U6作為內(nèi)參,采用qRT-PCR檢測了miR-199a在腎癌病變及癌旁組織中的表達。熒光定量PCR溶解曲線顯示miR-199a及U6引物特異性高,無非特異性擴增和引物二聚體干擾,結(jié)果表明miR-199a表達于腎癌組織,與配對的癌旁組織相比,平均下調(diào)2-4倍,差異顯著,有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結(jié)合患者的相關(guān)資料,我們分析了miR-199a表達與患者預后的關(guān)系。結(jié)果顯示miR-199a下調(diào)病人平均生存時間為(41.147±8.713)個月,中位生存時間為34.4個月,miR-199a上調(diào)患者平均生存時間為(71.377±7.125)個月,中位生存時間分別為70.1個月。miR-199a低表達患者的1年及3年生存率分別為83.4%、14.7%；miR-199a高表達患者1年及3年生存率分別為93.2%、48.7%,二者差異顯著,具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。經(jīng)COX多因素分析,結(jié)果顯示在排除腫瘤大小、TNM分期、臨床分期等因素的影響后,miR-199a低表達可作為腫瘤特異性死亡的危險因素(RR=1.714,95%CI:1.127-2.216, P=0.03)。2. miR-199a通過調(diào)控靶基因ROCK-1影響腎癌細胞的增殖、侵襲及凋亡為明確miR-199a可能調(diào)控的靶基因,我們選擇了3個預測軟件預測結(jié)果的交集作為miR-199a的候選靶基因。結(jié)果表明R0CK1的mRNA序列中存在著miR-199a的一段互補序列,即結(jié)合位點。因此,我們認為ROCK1可能為miR-199a下游調(diào)控的直接靶基因之一。為了驗證ROCK1是否為miR-199a的直接靶基因,我們構(gòu)建了ROCK1野生型及突變型載體,并克隆形成熒光素酶載體,將其與空載對照載體分別與miR-199共轉(zhuǎn)染腎癌A498細胞株。結(jié)果表明miR-199a明顯抑制野生型ROCK1的表達(P0.05),卻不能影響突變型ROCK1表達。同時,我們采用qRT-PCR及Western blot檢測野生型ROCK1在]miR-199a過表達細胞株中的表達情況,結(jié)果均顯示miR-199a過表達后,ROCKl表達明顯減低(P0.01)。為探討miR-199a調(diào)控靶基因ROCK-1對腎癌細胞增殖能力的影響,我們首先采用MTT實驗檢測了細胞的增殖能力,結(jié)果示miR-199a過表達明顯抑制腎癌細胞的增殖；然而,當miR-199a與ROCK-1共轉(zhuǎn)染后,ROCK-1在一定程度上可減輕miR-199a過表達對腎癌細胞增殖能力的抑制作用,但其增殖能力仍明顯強于miR-199a過表組(P0.01)。同時,我們也采用平板克隆實驗檢測了細胞的增殖能力,結(jié)果顯示miR-199a過表達后,細胞的克隆數(shù)明顯低于對照組,同時明顯低于miR-199a與ROCK-1共轉(zhuǎn)染組,提示miR-199a表達能明顯抑制腎癌細胞的增殖。為探討miR-199a調(diào)控靶基因ROCK-1對腎癌細胞侵襲能力的影響,我們進行了Transwell侵襲實驗,結(jié)果示miR-199a過表達后,細胞的侵襲數(shù)明顯低于對照組及miR-199a與ROCK-1共轉(zhuǎn)染組,但是恢復ROCK-1的表達能部分抑制miR-199所引起的侵襲抑制作用(P0.01)。為探討miR-199a調(diào)控靶基因ROCK-1對腎癌細胞凋亡能力的影響,我們又進行了流式細胞儀檢測,結(jié)果提示miR-199a過表達后,細胞凋亡率明顯增加,但ROCK-1過表達能部分抑制miR-199a過表達所引起的細胞凋亡。3. miR-199a過表達及miR-199a/ROCK-1共表達對腎癌細胞體內(nèi)生物學特性的影響為了進一步明確miR-199a對腎癌細胞生長的影響,我們將miR-199過表達及空載對照慢病毒轉(zhuǎn)染了腎癌A498細胞株,行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗,結(jié)果表明miR-199a過表達腎癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長明顯受到抑制,形成的腫瘤重量明顯低于空載對照組。收集空載對照組(LV-ctrl)及miR-199a過表達實驗組形成的腫瘤組織,采用免疫組化檢測ROCK-1及增殖指標Ki-67的表達情況,結(jié)果顯示ROCK-1在miR-199a過表達的實驗組腫瘤中的表達明顯低于對照組,Ki-67在miR-199a過表達的實驗組腫瘤中的表達也明顯低于對照組,提示miR-199a過表達后腫瘤的增殖及侵襲能力下降。隨后,我們也通過qRT-PCR定量檢測了ROCK-1在39例腎癌組織中的表達,并分析了其表達與腎癌組織中miR-199表達的關(guān)系。結(jié)果表明ROCK-1高表達于腎癌組織,其表達與miR-199a表達呈明顯的負相關(guān)(P0.01),相關(guān)系數(shù)為0.7665。4. miR-199a上游調(diào)控因子的預測和鑒定依據(jù)mRNA編碼蛋白的原理,miRNA也是由其基因DNA轉(zhuǎn)錄而成,每一個miRNA的表達都是由一個啟動子啟動及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。因此,我們查閱了相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)miR-199a基因序列中有一個Snail轉(zhuǎn)錄子的結(jié)合位點,初步判斷Snail可能為miR-199a上游調(diào)控的候選基因。隨后,我們將miR-199a上的Snail啟動子結(jié)合位點進行了克隆,命名為pGL3-miR-199a pro,并進行了熒光素酶報告實驗,結(jié)果顯示這個位點的區(qū)域也包含了miR-199a的初級轉(zhuǎn)錄物的啟動子,并可以激發(fā)熒光素的表達。同時,我們將pGL3-miR-199a pro及空載分別與Snail進行共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)pGL3-miR-199a pro與Snail共轉(zhuǎn)染后,熒光素表達活性明顯降低。此外,qRT-PCR檢測結(jié)果表明Snail過表達能抑制miR-199表達,Northern blot結(jié)果也顯示Snail過表達能抑制miR-199a表達。為了進一步驗證Snail與miR-199a的相關(guān)性,我們采用qRT-PCR定量檢測了39例腎癌組織中Snail的表達,結(jié)果顯示Snail高表達于腎癌組織,其表達與miR-199a呈負性相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.6376(P0.05)。因此,這些結(jié)果提示Snail是miR-199a的上游調(diào)控基因。結(jié)論1.miR-199a表達腎癌組織,其高表達患者預后較好;2. miR-199靶向調(diào)控下游基因ROCK-1,參與調(diào)控腎癌細胞的增殖、侵襲及凋亡；3. Snail為miR-199a的上游調(diào)控基因；本研究的創(chuàng)新之處1. 通過實驗證實miR-199a低表達腎癌組織,其高表達患者預后較好；2. 首次揭示了miR-199a靶向調(diào)控下游基因ROCK-1,參與調(diào)控腎癌細胞的增殖、侵襲及凋亡；3. 首次明確了Snail可作為miR-199a的上游調(diào)控基因,進一步闡述了miR-199a在腎癌中的作用機制；
【關(guān)鍵詞】：腎癌 miR-199a ROCK-1 Snail 靶基因 作用機制
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.11
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-32
• 參考文獻25-32
• 第一章 miR－199a在腎癌組織中的表達及其意義32-45
• 一、材料和方法32-36
• 二、結(jié)果36-39
• 三、討論39-41
• 參考文獻41-45
• 第二章 miR-199a調(diào)控靶基因ROCK-1影響腎癌細胞的增殖、侵襲及凋亡45-67
• 一、材料與方法45-58
• 二、結(jié)果58-62
• 三、討論62-64
• 參考文獻64-67
• 第三章 miR-199a過表達及miR-199a/ROCK1共表達對腎癌細胞體內(nèi)生物學特性的影響67-76
• 一、材料及方法67-71
• 二、結(jié)果71-73
• 三、討論73-75
• 參考文獻75-76
• 第四章 miR-199a上游調(diào)控因子的預測和鑒定76-96
• 一、材料及方法76-88
• 二、結(jié)果88-90
• 三、討論90-92
• 參考文獻92-96
• 全文小結(jié)96-99
• 綜述99-113
• 參考文獻107-113
• 縮略語113-114
• 攻讀博士學位期間發(fā)表論文情況114-115
• 攻讀博士學位期間申請基金情況115-116
• 致謝116-118
• 統(tǒng)計學審稿證明118

  本文關(guān)鍵詞：miR-199靶向調(diào)控ROCK1影響腎癌細胞增殖、侵襲及凋亡的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：301359