本文關(guān)鍵詞：表觀遺傳調(diào)控在人乳腺癌中的作用及機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分RASSF6在人乳腺癌中的甲基化檢測(cè)及功l機(jī)制研究目的：1檢測(cè)RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員6(Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 6, RASSF6)在人乳腺癌細(xì)胞株中及乳腺癌組織中的表達(dá)情況；2檢測(cè)RASSF6啟動(dòng)子CpG島在人乳腺癌細(xì)胞株和人乳腺癌組織中甲基化情況；3驗(yàn)證RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖,細(xì)胞周期,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞遷移侵襲方面的調(diào)控作用；4探討介導(dǎo)RASSF6抑癌作用相關(guān)的信號(hào)通路改變。方法：1 采用RT-PCR檢測(cè)RASSF6在人正常組織、人乳腺癌細(xì)胞株和人正常乳腺組織中的表達(dá)情況；采用Western blot檢測(cè)RASSF6在人乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況；采用Real-time PCR檢測(cè)RASSF6在人乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況；分析Oncomine微陣列芯片數(shù)據(jù)庫(kù)中,RASSF6在人乳腺癌正常組織及癌組織中的表達(dá)情況。2使用甲基化特異性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)檢測(cè)RASSF6在人乳腺癌細(xì)胞株和人乳腺癌組織中的啟動(dòng)子甲基化情況；使用BGS檢測(cè)#115號(hào)乳腺癌樣本中RASSF6啟動(dòng)子甲基化情況。3體外實(shí)驗(yàn)中,使用平板克隆實(shí)驗(yàn),軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn),CCK-8實(shí)驗(yàn),EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用。4體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,使用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用。5采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期的調(diào)控作用,并采用Western blot檢測(cè)RASSF6對(duì)p21和p27的調(diào)控作用。6采用AO/EB染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,并用Western blot檢測(cè)cleaved-caspase3, cleaved-caspase7, cleaved-caspase9, cleaved-PARP的變化。7采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用；采用Transwell小室檢測(cè)RASSF6對(duì)人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控作用；采用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)RASSF6對(duì)S100A4,MMP2的調(diào)節(jié)作用。8采用Western blot檢測(cè)RASSF6對(duì)Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用。結(jié)果：1 RASSF6在人正常組織和人正常乳腺組織中廣泛表達(dá)；而在人乳腺癌細(xì)胞株中,多個(gè)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)或缺失,包括BT549和MDA-MB-231等三陰性乳腺癌細(xì)胞株；相對(duì)于人乳腺癌旁組織,RASSF6在人乳腺癌組織的表達(dá)顯著下調(diào)。2 RASSF6在BT549和MDA-MB-231細(xì)胞株中檢測(cè)到甲基化,在人乳腺癌組織中檢測(cè)到廣泛甲基化。3體外實(shí)驗(yàn)中,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示RASSF6可顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力；CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示出RASSF6抑制增殖的能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,RASSF6可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)速度。4流式細(xì)胞結(jié)果顯示RASSF6可顯著抑制G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換,且顯著上調(diào)p21；AO/EB染色和流式細(xì)胞結(jié)果顯示RASSF6可誘導(dǎo)人乳腺癌凋亡,且caspase3,caspase7,caspase9,PARP發(fā)生剪切。5劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示RASSF6可顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲,且顯著下調(diào)S100A4和MMP2的表達(dá)。6 Western blot結(jié)果顯示RASSF6可顯著下調(diào)Akt的磷酸化水平,而Akt為S100A4和MMP2的上游信號(hào)通路.結(jié)論：1 RASSF6由于啟動(dòng)子DNA甲基化導(dǎo)致其在人乳腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)。2 RASSF6通過(guò)抑制Akt信號(hào)通路調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。第二部分miR-7-5p靶向REGγ抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖目的：1 驗(yàn)證敲減miR-7-5p對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用以及對(duì)REGγ表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。2 驗(yàn)證REGy是否會(huì)逆轉(zhuǎn)miR-7-5p抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖功能。3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-7-5p抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖。方法：1使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-7-5p抑制劑抑制miR-7-5p的表達(dá),采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以及使用Western blot檢測(cè)REGy蛋白水平變化；并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期改變。2共轉(zhuǎn)染miR-7-5p和REGy,采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力以及采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變。3使用過(guò)表達(dá)RASSF6的細(xì)胞株以及對(duì)照細(xì)胞株構(gòu)建裸鼠移植瘤模型；測(cè)量移植瘤的體積和重量；且使用免疫組化檢測(cè)Ki-67和REGy的變化。4提取Oncomine微陣列芯片數(shù)據(jù)驗(yàn)證在同樣的乳腺癌組織中miR-7-5p和REGy之間的相關(guān)性。結(jié)果：1 敲減miR-7-5p可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的增殖能力,促進(jìn)G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化,且REGy蛋白水平有顯著上調(diào)。2 REGy可部分逆轉(zhuǎn)miR-7-5p的抑增殖功能,細(xì)胞周期結(jié)果顯示出相同的變化。3移植瘤構(gòu)建成功,miR-7-5p可顯著抑制移植瘤的生長(zhǎng)；移植瘤切片顯示增殖相關(guān)基因Ki-67顯著下調(diào)及REGy蛋白水平顯著下調(diào)。結(jié)論：1 miR-7-5p可通過(guò)靶向REGy抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖,REGy為miR-7-5p下游靶基因。
【關(guān)鍵詞】：RASSF6 DNA甲基化 Akt信號(hào)通路 miR-7-5p REGγ 增殖
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-12
• 英文摘要12-17
• 前言17-20
• 第一部分 RASSF6在人乳腺癌中的甲基化檢測(cè)及功能機(jī)制20-57
• 1 材料與方法20-36
• 2 結(jié)果36-53
• 3 討論53-56
• 參考文獻(xiàn)56-57
• 第二部分 miR-7-5p靶向REGγ機(jī)制人乳腺癌細(xì)胞增殖57-74
• 1 材料與方法58-65
• 2 結(jié)果65-70
• 3 討論70-72
• 參考文獻(xiàn)72-74
• 結(jié)論74-75
• 文獻(xiàn)綜述75-82
• 參考文獻(xiàn)80-82
• 致謝82-83
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章83

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