本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：缺血性腦卒中最常見(jiàn)的高致殘致死率的疾病之一,積極預(yù)防和治療缺血性腦卒中,降低致殘率和死亡率具有重大的社會(huì)意義。目前,唯一被證實(shí)能縮小腦梗死面積、減輕神經(jīng)損傷的治療藥物是重組組織型纖溶酶原激活物的溶栓治療,但由于其嚴(yán)格時(shí)間窗限制,導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到極大限制。且即使接受有效的溶栓治療,仍有很多患者遺留下嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺陷。隨著干細(xì)胞組織工程的發(fā)展,干細(xì)胞移植治療給缺血性腦卒中患者的治療和功能恢復(fù)帶來(lái)了希望。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易獲取、易擴(kuò)增、不存在倫理問(wèn)題以及免疫原性低等優(yōu)勢(shì),被認(rèn)為是干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中最有優(yōu)勢(shì)的種子細(xì)胞。許多體內(nèi)體外研究均證實(shí),移植的BMSCs能夠遷移到缺血性損傷灶周?chē)?從而發(fā)揮損傷細(xì)胞替代、神經(jīng)保護(hù)、血管再生、免疫調(diào)節(jié)等治療功效。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞中含量最多的一種支持細(xì)胞,它具有維持谷氨酸代謝平衡,維持水代謝平衡,免疫調(diào)節(jié),腦血管屏障的組成和維持,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌等多種功能,是保證正常神經(jīng)血管單元結(jié)構(gòu)和腦神經(jīng)元正常電生理活動(dòng)的重要支持細(xì)胞。缺血性腦卒中后,星形膠質(zhì)細(xì)胞最先受創(chuàng),損傷灶的星形膠質(zhì)細(xì)胞多數(shù)發(fā)生凋亡,凋亡后導(dǎo)致細(xì)胞正常生理功能受損,大量炎性因子釋放,將進(jìn)一步引起級(jí)聯(lián)反應(yīng),引發(fā)神經(jīng)功能紊亂。未發(fā)生凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)反應(yīng)性增生,導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成,過(guò)度活化釋放谷氨酸、NO和炎性因子,神經(jīng)元內(nèi)外離子平衡紊亂,分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等。因此,關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦卒中相關(guān)作用的的研究具有重要意義。盡管,越來(lái)越多研究者從事BMSCs移植治療缺血性腦卒中相關(guān)機(jī)制的探討,并已有相關(guān)證據(jù)證實(shí)BMSCs可通過(guò)結(jié)構(gòu)整合、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞旁分泌等方面發(fā)揮療效。但尚少有從"BMSCs旁分泌與星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和功能關(guān)系”的角度來(lái)揭示這種治療機(jī)制,本課題以此為關(guān)注焦點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,旨在進(jìn)一步完善BMSCs移植治療缺血性腦卒中療效機(jī)制的證據(jù)。研究表明,移植后的BMSCs通過(guò)分泌各種旁分泌因子(包括細(xì)胞因子、趨化因子和營(yíng)養(yǎng)因子等)與損傷灶周?chē)母鞣N腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互影響,發(fā)揮抗凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管再生、化學(xué)趨向、抗膠質(zhì)瘢痕形成、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化等旁分泌作用。本課題分別以大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)和氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型為基礎(chǔ),首先在大鼠MCAO模型急性期,給予局灶注射BMSCs及其上清液(bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium,BMSC-CM,含旁分泌因子),干預(yù)7d后,觀(guān)察比較腦梗塞面積和神經(jīng)功能恢復(fù)情況,并檢測(cè)了神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡以及星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生。結(jié)果表明,注射的BMSC-CM與BMSCs相似均能夠產(chǎn)生治療作用,均能抑制局灶星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和反應(yīng)性增生。上述實(shí)驗(yàn)間接提示了BMSCs能夠通過(guò)分泌旁分泌因子保護(hù)缺血性腦卒中后引起的損傷,并能夠抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和反應(yīng)性增生。為進(jìn)一步研究BMSCs旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和反應(yīng)性增生影響的具體機(jī)制,本課題在體外OGD模型的基礎(chǔ)上,對(duì)損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用BMSC-CM或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)進(jìn)行干預(yù)(再灌注),以損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活和反應(yīng)性增生情況為檢測(cè)指標(biāo),并研究p38 MAPK和JNK,以及其下游通路p53和STAT1在旁分泌因子對(duì)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的中發(fā)揮的作用。結(jié)果表明,旁分泌因子通過(guò)抑制p38 MAPK和JNK信號(hào)通路,進(jìn)而保護(hù)OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞,減少細(xì)胞凋亡并抑制GFAP的過(guò)表達(dá),且p38 MAPK和JNK信號(hào)通路的下游分子p53與STAT1也參與了該過(guò)程。另外,缺血性腦卒中后引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌紊亂、谷氨酸／水代謝失衡以及細(xì)胞興奮毒性等內(nèi)環(huán)境的紊亂,進(jìn)一步加重了神經(jīng)細(xì)胞的損傷和神經(jīng)功能的紊亂。本課題在體外OGD模型的基礎(chǔ)上,對(duì)損傷后的星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用BMSC-CM或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)進(jìn)行干預(yù)(再灌注),觀(guān)察了損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的ROS產(chǎn)生,炎癥因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、水通道蛋白以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BMSCs旁分泌因子能夠減少OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,抑制炎癥反應(yīng)和水通道蛋白表達(dá)、促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)。以上結(jié)果提示,BMSCs旁分泌因子能夠改善OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的紊亂。本文內(nèi)容結(jié)構(gòu)第一章BMSCs旁分泌因子對(duì)大鼠MCAO模型腦損傷及損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和反應(yīng)性增生的影響[目的]觀(guān)察BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)對(duì)MCAO后大鼠腦梗塞面積和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響,推斷BMSCs旁分泌因子在急性期缺血性腦損傷修復(fù)過(guò)程中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和反應(yīng)性增生的作用。[方法]構(gòu)建大鼠MCAO模型,在急性期(即栓塞2h,再灌注6h后)應(yīng)用立體定向注射技術(shù),依組分別向MCAO模型鼠損傷灶注射PBS (Venicle組)、BMSCs (BM組)或BMSC-CM(含旁分泌因子,CM組)對(duì)缺血性腦損傷進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。7d后,TTC染色法檢測(cè)腦梗塞面積；改良NSS評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能恢復(fù)情況;TUNEL檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡,免疫熒光和Western bolt檢測(cè)Caspase3和GFAP蛋白表達(dá)。[結(jié)果]以下各組,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。局灶注射BMSC-CM(BM組)及BMSC-CM (CM組)均能夠有效減少腦梗塞面積,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),與對(duì)照組(Venicle組)比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),且BM組的改善效果比CM組更加明顯(p0.05)。另外,BMSC-CM及BMSC-CM均能減少損傷灶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡(p0.05),抑制凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)(p0.05),且對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生具有明顯抑制作用,顯著減少GFAP的蛋白表達(dá)(p0.05)。[結(jié)論]BMSC-CM (含旁分泌因子)對(duì)MCAO模型鼠的干預(yù),與移植的BMSCs具有相似的治療效果,能有效減少腦梗塞面積,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),并能減少損傷灶神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生。提示,移植的BMSCs能通過(guò)旁分泌因子發(fā)揮上述療效。第二章BMSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及反應(yīng)性增生的影響及機(jī)制探討[目的]進(jìn)一步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對(duì)缺血性損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和反應(yīng)性增生的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。[方法]以體外構(gòu)建的缺血性腦卒中模型(OGD模型)為基礎(chǔ),對(duì)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞用全培培養(yǎng)基(單純OGD/再灌注組,Standard組)、BMSC-CM(含旁分泌因子,Conditioned組)或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)(Co-cultured組)進(jìn)行干預(yù),以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD/再灌注損傷。OGD 6h,再灌注24h后,CCK8檢測(cè)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性,TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡,Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2和Caspase3的蛋白表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP骨架蛋白表達(dá),并觀(guān)察腫大細(xì)胞數(shù)變化,Western blot檢測(cè)GFAP蛋白表達(dá)情況。為進(jìn)一步研究相關(guān)分子機(jī)制,p38 MAPK和JNK通路的抑制劑和激活劑,以及p38 MAPK和JNK下游通路p53和STAT1的抑制劑對(duì)上述模型加以干預(yù),干預(yù)后采用同樣方式檢測(cè)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活和反應(yīng)性增生情況。[結(jié)果]以下各組,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05) BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)均能夠增加OGD/再灌注后損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(p0.05)；減少細(xì)胞的凋亡(p0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax (p0.05)和Caspase3(p0.05),促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(dá)(p0.05),與單純OGD/再灌注組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。另外,旁分泌因子還能減少腫大的星形膠質(zhì)細(xì)胞個(gè)數(shù),并能顯著下調(diào)GFAP的過(guò)表達(dá)(p0.05)。BMSCs及BMSC-CM干預(yù)后,單純OGD/再灌注激活的p38 MAPK和JNK及其下游通路p53和STAT1均被抑制,p-p38、p-JNK、p-p53、p53和p-STAT1蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)(p0.05)。與單純OGD/再灌注組相比,p38 MAPK和JNK信號(hào)通路抑制劑,能夠顯著增加損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(p0.05),減少細(xì)胞的凋亡(p0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax (p0.05)和Caspase3 (p0.05),促進(jìn)抑凋亡蛋白Bc12的蛋白表達(dá)(p0.05)；并能顯著下調(diào)GFAP的過(guò)表達(dá)(p0.05)。單純OGD/再灌注損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞被p38 MAPK和JNK激動(dòng)劑干預(yù)后,損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性顯著下降(p0.05),凋亡數(shù)增加,促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達(dá)量增加(p0.05),抑凋亡蛋白Bc12表達(dá)量下降(p0.05),并增加了GFAP的表達(dá)(p0.05); BMSC-CM加入p38 MAPK和JNK激動(dòng)劑后,旁分泌因子對(duì)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的改善,細(xì)胞凋亡數(shù)和Bax,Caspase3, GFAP蛋白表達(dá)的抑制,Bcl2表達(dá)的促進(jìn)作用均受到抑制(p0.05)。另外,與單純OGD/再灌注組相比,p53和STAT1信號(hào)通路抑制劑,能夠顯著增加損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性(p0.05),減少細(xì)胞的凋亡(p0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase3,促進(jìn)抑凋亡蛋白Bc12的蛋白表達(dá)(p0.05); STAT1能顯著下調(diào)GFAP的過(guò)表達(dá)(p0.05),p53則無(wú)此效果(p0.05)。[結(jié)論]BMSCs旁分泌因子通過(guò)抑制p38 MAPK和JNK信號(hào)通路,進(jìn)而保護(hù)OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞,減少細(xì)胞凋亡并抑制GFAP的過(guò)表達(dá),且p38 MAPK和JNK信號(hào)通路的下游分子p53與STAT1也參與了該過(guò)程。因此,BMSCs旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的藥理學(xué)作用是缺血性腦卒中治療的有效方式之一,其中p38 MAPK和JNK信號(hào)通路將會(huì)是潛在有效的治療靶點(diǎn)。第三章BMSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞其它生物學(xué)功能的影響[目的]初步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌、水通道蛋白以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響。[方法]以體外構(gòu)建的缺血性腦卒中模型(OGD模型)為基礎(chǔ),對(duì)損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞用全培培養(yǎng)基(單純OGD/再灌注組,Standard組)、BMSC-CM(含旁分泌因子,Conditioned組)或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)(Co-cultured組)進(jìn)行干預(yù),以誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的OGD/再灌注損傷。OGD 6h,再灌注24h后,DCFH-DA檢測(cè)ROS的產(chǎn)生,qPCR檢測(cè)免疫調(diào)節(jié)蛋白和炎癥因子(COX2,iNOS,TLR4,IL-6,IL-1β,TNF-α和IL-10),神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(VEGF, BDNF和bFGF),水通道蛋白(AQP4)以及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT1和EAAT2)的mRNA表達(dá)情況。[結(jié)果]以下各組,組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)均能夠減少ROS的產(chǎn)生,抑制免疫調(diào)節(jié)蛋白和促炎因子COX2,iNOS,TLR4,IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA表達(dá),促進(jìn)抑炎因子IL-10和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子VEGF,BDNF,bFGF的mRNA表達(dá),并抑制水通道蛋白AQP4的mRNA上調(diào)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1, EAAT2的mRNA下調(diào),與單純OGD/再灌注比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。[結(jié)論]BMSCs旁分泌因子能夠抑制OGD/再灌注后損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生；并能抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng),減少促炎的免疫調(diào)節(jié)蛋白和免疫反應(yīng)因子的表達(dá)(IL-6,IL-1β,TNF-α,COX2,iNOS和TLR4),同時(shí)也增加促炎因子IL-10的表達(dá)；促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子VEGF, BDNF和bFGF的表達(dá)；抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4的過(guò)表達(dá),減輕腦水腫；增加OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1/EAAT2的表達(dá),調(diào)節(jié)損傷后谷氨酸代謝的紊亂。
【關(guān)鍵詞】：缺血性腦卒中 氧糖剝奪 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 旁分泌因子 星形膠質(zhì)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 BMSCs旁分泌因子對(duì)大鼠MCAO模型腦損傷及損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性和反應(yīng)性增生的影響20-50
• 1.1 前言20-22
• 1.2 材料和方法22-33
• 1.3 結(jié)果33-41
• 1.4 討論41-43
• 1.5 結(jié)論43-44
• 1.6 附圖44-45
• 1.7 參考文獻(xiàn)45-50
• 第二章 BMSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及反應(yīng)性增生的影響及機(jī)制探討50-102
• 2.1 前言50-52
• 2.2 材料和方法52-62
• 2.3 結(jié)果62-88
• 2.4 討論88-92
• 2.5 結(jié)論92-93
• 2.6 附圖93
• 2.7 參考文獻(xiàn)93-102
• 第三章 BMSCs旁分泌因子對(duì)OGD/再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞其它生物學(xué)功能的影響102-133
• 3.1 前言102-104
• 3.2 材料和方法104-109
• 3.3 結(jié)果109-119
• 3.4 討論119-123
• 3.5 結(jié)論123-124
• 3.6 附圖124-125
• 3.7 參考文獻(xiàn)125-133
• 全文小結(jié)133-135
• 中英文對(duì)照縮略詞表135-137
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文137-138
• 致謝138-141
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)證明141

  本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌因子對(duì)缺血性腦卒中后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性及功能的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：290064