本文關鍵詞：骨髓間充質干細胞旁分泌因子對缺血性腦卒中后星形膠質細胞活性及功能的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：缺血性腦卒中最常見的高致殘致死率的疾病之一,積極預防和治療缺血性腦卒中,降低致殘率和死亡率具有重大的社會意義。目前,唯一被證實能縮小腦梗死面積、減輕神經(jīng)損傷的治療藥物是重組組織型纖溶酶原激活物的溶栓治療,但由于其嚴格時間窗限制,導致臨床應用受到極大限制。且即使接受有效的溶栓治療,仍有很多患者遺留下嚴重的神經(jīng)功能缺陷。隨著干細胞組織工程的發(fā)展,干細胞移植治療給缺血性腦卒中患者的治療和功能恢復帶來了希望。由于骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易獲取、易擴增、不存在倫理問題以及免疫原性低等優(yōu)勢,被認為是干細胞移植治療缺血性腦卒中最有優(yōu)勢的種子細胞。許多體內體外研究均證實,移植的BMSCs能夠遷移到缺血性損傷灶周圍,從而發(fā)揮損傷細胞替代、神經(jīng)保護、血管再生、免疫調節(jié)等治療功效。星形膠質細胞是神經(jīng)細胞中含量最多的一種支持細胞,它具有維持谷氨酸代謝平衡,維持水代謝平衡,免疫調節(jié),腦血管屏障的組成和維持,神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌等多種功能,是保證正常神經(jīng)血管單元結構和腦神經(jīng)元正常電生理活動的重要支持細胞。缺血性腦卒中后,星形膠質細胞最先受創(chuàng),損傷灶的星形膠質細胞多數(shù)發(fā)生凋亡,凋亡后導致細胞正常生理功能受損,大量炎性因子釋放,將進一步引起級聯(lián)反應,引發(fā)神經(jīng)功能紊亂。未發(fā)生凋亡的細胞出現(xiàn)反應性增生,導致膠質瘢痕形成,過度活化釋放谷氨酸、NO和炎性因子,神經(jīng)元內外離子平衡紊亂,分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等。因此,關于星形膠質細胞在缺血性腦卒中相關作用的的研究具有重要意義。盡管,越來越多研究者從事BMSCs移植治療缺血性腦卒中相關機制的探討,并已有相關證據(jù)證實BMSCs可通過結構整合、免疫調節(jié)和細胞旁分泌等方面發(fā)揮療效。但尚少有從"BMSCs旁分泌與星形膠質細胞活性和功能關系”的角度來揭示這種治療機制,本課題以此為關注焦點進行實驗研究,旨在進一步完善BMSCs移植治療缺血性腦卒中療效機制的證據(jù)。研究表明,移植后的BMSCs通過分泌各種旁分泌因子(包括細胞因子、趨化因子和營養(yǎng)因子等)與損傷灶周圍的各種腦實質細胞相互影響,發(fā)揮抗凋亡、免疫調節(jié)、血管再生、化學趨向、抗膠質瘢痕形成、神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)干細胞的誘導分化等旁分泌作用。本課題分別以大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)和氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型為基礎,首先在大鼠MCAO模型急性期,給予局灶注射BMSCs及其上清液(bone marrow mesenchymal stem cell-conditioned medium,BMSC-CM,含旁分泌因子),干預7d后,觀察比較腦梗塞面積和神經(jīng)功能恢復情況,并檢測了神經(jīng)組織細胞凋亡以及星形膠質細胞反應性增生。結果表明,注射的BMSC-CM與BMSCs相似均能夠產(chǎn)生治療作用,均能抑制局灶星形膠質細胞的凋亡和反應性增生。上述實驗間接提示了BMSCs能夠通過分泌旁分泌因子保護缺血性腦卒中后引起的損傷,并能夠抑制星形膠質細胞的凋亡和反應性增生。為進一步研究BMSCs旁分泌因子對缺血性腦卒中后星形膠質細胞活性和反應性增生影響的具體機制,本課題在體外OGD模型的基礎上,對損傷后的星形膠質細胞應用BMSC-CM或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)進行干預(再灌注),以損傷星形膠質細胞的存活和反應性增生情況為檢測指標,并研究p38 MAPK和JNK,以及其下游通路p53和STAT1在旁分泌因子對損傷星形膠質細胞影響的中發(fā)揮的作用。結果表明,旁分泌因子通過抑制p38 MAPK和JNK信號通路,進而保護OGD/再灌注后損傷的星形膠質細胞,減少細胞凋亡并抑制GFAP的過表達,且p38 MAPK和JNK信號通路的下游分子p53與STAT1也參與了該過程。另外,缺血性腦卒中后引起的星形膠質細胞氧化應激、炎癥因子釋放、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌紊亂、谷氨酸／水代謝失衡以及細胞興奮毒性等內環(huán)境的紊亂,進一步加重了神經(jīng)細胞的損傷和神經(jīng)功能的紊亂。本課題在體外OGD模型的基礎上,對損傷后的星形膠質細胞應用BMSC-CM或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)進行干預(再灌注),觀察了損傷星形膠質細胞的ROS產(chǎn)生,炎癥因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、水通道蛋白以及谷氨酸轉運體mRNA表達的情況。結果發(fā)現(xiàn),BMSCs旁分泌因子能夠減少OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞ROS的產(chǎn)生,抑制炎癥反應和水通道蛋白表達、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子和谷氨酸轉運體的表達。以上結果提示,BMSCs旁分泌因子能夠改善OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞功能的紊亂。本文內容結構第一章BMSCs旁分泌因子對大鼠MCAO模型腦損傷及損傷后星形膠質細胞活性和反應性增生的影響[目的]觀察BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)對MCAO后大鼠腦梗塞面積和神經(jīng)功能恢復的影響,推斷BMSCs旁分泌因子在急性期缺血性腦損傷修復過程中對星形膠質細胞活性和反應性增生的作用。[方法]構建大鼠MCAO模型,在急性期(即栓塞2h,再灌注6h后)應用立體定向注射技術,依組分別向MCAO模型鼠損傷灶注射PBS (Venicle組)、BMSCs (BM組)或BMSC-CM(含旁分泌因子,CM組)對缺血性腦損傷進行實驗性治療。7d后,TTC染色法檢測腦梗塞面積；改良NSS評分評估神經(jīng)功能恢復情況;TUNEL檢測神經(jīng)細胞凋亡,免疫熒光和Western bolt檢測Caspase3和GFAP蛋白表達。[結果]以下各組,組間差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。局灶注射BMSC-CM(BM組)及BMSC-CM (CM組)均能夠有效減少腦梗塞面積,促進神經(jīng)功能恢復,與對照組(Venicle組)比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05),且BM組的改善效果比CM組更加明顯(p0.05)。另外,BMSC-CM及BMSC-CM均能減少損傷灶神經(jīng)細胞的凋亡(p0.05),抑制凋亡蛋白Caspase3的表達(p0.05),且對星形膠質細胞的反應性增生具有明顯抑制作用,顯著減少GFAP的蛋白表達(p0.05)。[結論]BMSC-CM (含旁分泌因子)對MCAO模型鼠的干預,與移植的BMSCs具有相似的治療效果,能有效減少腦梗塞面積,促進神經(jīng)功能恢復,并能減少損傷灶神經(jīng)細胞的凋亡和星形膠質細胞的增生。提示,移植的BMSCs能通過旁分泌因子發(fā)揮上述療效。第二章BMSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞活性及反應性增生的影響及機制探討[目的]進一步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對缺血性損傷后星形膠質細胞凋亡和反應性增生的調節(jié)作用及其機制。[方法]以體外構建的缺血性腦卒中模型(OGD模型)為基礎,對損傷后星形膠質細胞用全培培養(yǎng)基(單純OGD/再灌注組,Standard組)、BMSC-CM(含旁分泌因子,Conditioned組)或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)(Co-cultured組)進行干預,以誘導星形膠質細胞的OGD/再灌注損傷。OGD 6h,再灌注24h后,CCK8檢測損傷星形膠質細胞的活性,TUNEL檢測細胞凋亡,Western blot檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl2和Caspase3的蛋白表達；免疫熒光檢測損傷星形膠質細胞GFAP骨架蛋白表達,并觀察腫大細胞數(shù)變化,Western blot檢測GFAP蛋白表達情況。為進一步研究相關分子機制,p38 MAPK和JNK通路的抑制劑和激活劑,以及p38 MAPK和JNK下游通路p53和STAT1的抑制劑對上述模型加以干預,干預后采用同樣方式檢測損傷星形膠質細胞的存活和反應性增生情況。[結果]以下各組,組間差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05) BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)均能夠增加OGD/再灌注后損傷星形膠質細胞的活性(p0.05)；減少細胞的凋亡(p0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax (p0.05)和Caspase3(p0.05),促進抑凋亡蛋白Bcl2的蛋白表達(p0.05),與單純OGD/再灌注組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。另外,旁分泌因子還能減少腫大的星形膠質細胞個數(shù),并能顯著下調GFAP的過表達(p0.05)。BMSCs及BMSC-CM干預后,單純OGD/再灌注激活的p38 MAPK和JNK及其下游通路p53和STAT1均被抑制,p-p38、p-JNK、p-p53、p53和p-STAT1蛋白表達均顯著下調(p0.05)。與單純OGD/再灌注組相比,p38 MAPK和JNK信號通路抑制劑,能夠顯著增加損傷星形膠質細胞的活性(p0.05),減少細胞的凋亡(p0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax (p0.05)和Caspase3 (p0.05),促進抑凋亡蛋白Bc12的蛋白表達(p0.05)；并能顯著下調GFAP的過表達(p0.05)。單純OGD/再灌注損傷的星形膠質細胞被p38 MAPK和JNK激動劑干預后,損傷星形膠質細胞的活性顯著下降(p0.05),凋亡數(shù)增加,促凋亡蛋白Bax和Caspase3表達量增加(p0.05),抑凋亡蛋白Bc12表達量下降(p0.05),并增加了GFAP的表達(p0.05); BMSC-CM加入p38 MAPK和JNK激動劑后,旁分泌因子對損傷星形膠質細胞活性的改善,細胞凋亡數(shù)和Bax,Caspase3, GFAP蛋白表達的抑制,Bcl2表達的促進作用均受到抑制(p0.05)。另外,與單純OGD/再灌注組相比,p53和STAT1信號通路抑制劑,能夠顯著增加損傷星形膠質細胞的活性(p0.05),減少細胞的凋亡(p0.05)；抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase3,促進抑凋亡蛋白Bc12的蛋白表達(p0.05); STAT1能顯著下調GFAP的過表達(p0.05),p53則無此效果(p0.05)。[結論]BMSCs旁分泌因子通過抑制p38 MAPK和JNK信號通路,進而保護OGD/再灌注后損傷的星形膠質細胞,減少細胞凋亡并抑制GFAP的過表達,且p38 MAPK和JNK信號通路的下游分子p53與STAT1也參與了該過程。因此,BMSCs旁分泌因子對缺血性腦卒中后損傷星形膠質細胞的藥理學作用是缺血性腦卒中治療的有效方式之一,其中p38 MAPK和JNK信號通路將會是潛在有效的治療靶點。第三章BMSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞其它生物學功能的影響[目的]初步探討B(tài)MSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞氧化應激、炎癥反應、神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌、水通道蛋白以及谷氨酸轉運體表達的影響。[方法]以體外構建的缺血性腦卒中模型(OGD模型)為基礎,對損傷后星形膠質細胞用全培培養(yǎng)基(單純OGD/再灌注組,Standard組)、BMSC-CM(含旁分泌因子,Conditioned組)或采用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與BMSCs共培養(yǎng)(Co-cultured組)進行干預,以誘導星形膠質細胞的OGD/再灌注損傷。OGD 6h,再灌注24h后,DCFH-DA檢測ROS的產(chǎn)生,qPCR檢測免疫調節(jié)蛋白和炎癥因子(COX2,iNOS,TLR4,IL-6,IL-1β,TNF-α和IL-10),神經(jīng)營養(yǎng)因子(VEGF, BDNF和bFGF),水通道蛋白(AQP4)以及谷氨酸轉運體(EAAT1和EAAT2)的mRNA表達情況。[結果]以下各組,組間差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。BMSCs及BMSC-CM(含旁分泌因子)均能夠減少ROS的產(chǎn)生,抑制免疫調節(jié)蛋白和促炎因子COX2,iNOS,TLR4,IL-6,IL-1β,TNF-α的mRNA表達,促進抑炎因子IL-10和神經(jīng)營養(yǎng)因子VEGF,BDNF,bFGF的mRNA表達,并抑制水通道蛋白AQP4的mRNA上調和谷氨酸轉運體EAAT1, EAAT2的mRNA下調,與單純OGD/再灌注比,差異均具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。[結論]BMSCs旁分泌因子能夠抑制OGD/再灌注后損傷的星形膠質細胞ROS的產(chǎn)生；并能抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞免疫炎癥反應,減少促炎的免疫調節(jié)蛋白和免疫反應因子的表達(IL-6,IL-1β,TNF-α,COX2,iNOS和TLR4),同時也增加促炎因子IL-10的表達；促進神經(jīng)營養(yǎng)因子VEGF, BDNF和bFGF的表達；抑制OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞AQP4的過表達,減輕腦水腫；增加OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞谷氨酸轉運體EAAT1/EAAT2的表達,調節(jié)損傷后谷氨酸代謝的紊亂。
【關鍵詞】：缺血性腦卒中 氧糖剝奪 骨髓間充質干細胞 旁分泌因子 星形膠質細胞
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 BMSCs旁分泌因子對大鼠MCAO模型腦損傷及損傷后星形膠質細胞活性和反應性增生的影響20-50
• 1.1 前言20-22
• 1.2 材料和方法22-33
• 1.3 結果33-41
• 1.4 討論41-43
• 1.5 結論43-44
• 1.6 附圖44-45
• 1.7 參考文獻45-50
• 第二章 BMSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞活性及反應性增生的影響及機制探討50-102
• 2.1 前言50-52
• 2.2 材料和方法52-62
• 2.3 結果62-88
• 2.4 討論88-92
• 2.5 結論92-93
• 2.6 附圖93
• 2.7 參考文獻93-102
• 第三章 BMSCs旁分泌因子對OGD/再灌注損傷后星形膠質細胞其它生物學功能的影響102-133
• 3.1 前言102-104
• 3.2 材料和方法104-109
• 3.3 結果109-119
• 3.4 討論119-123
• 3.5 結論123-124
• 3.6 附圖124-125
• 3.7 參考文獻125-133
• 全文小結133-135
• 中英文對照縮略詞表135-137
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文137-138
• 致謝138-141
• 統(tǒng)計學證明141

  本文關鍵詞：骨髓間充質干細胞旁分泌因子對缺血性腦卒中后星形膠質細胞活性及功能的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：290064