本文關鍵詞：NOD2對潘氏細胞系抗菌肽和白介素-23pl9表達的調節(jié)作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的克羅恩病(Crohn's disease, CD)是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的一種主要類型,是一種病因不明的慢性肉芽腫性炎癥性疾病。CD好發(fā)于回腸末端,空腸和上消化道少見,研究顯示多達75%的CD病人有回腸末端炎癥。回腸末端有兩個明顯的相關特征,即小腸在此部位的潘氏細胞數(shù)量和細菌濃度都是最高的,而且從近端小腸至遠端小腸潘氏細胞數(shù)量和細菌濃度會越來越多。這些特征表明CD的發(fā)病同潘氏細胞和腸道菌群之間有著密不可分的關系。潘氏細胞在腸黏膜的固有免疫中起到了非常重要的作用,它不但同吸收腸上皮細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞組成阻止腸道微生物入侵的防御性物理屏障,而且還通過分泌抗菌肽來維持腸道微生物和其宿主之間的腸道內穩(wěn)態(tài)的平衡。關于CD的發(fā)病機制,主要觀點認為減少的人類腸道抗菌肽不能有效清除腸道內微生物而導致腸道微生物同宿主之間的腸道內穩(wěn)態(tài)紊亂,而這種紊亂的腸道內環(huán)境最終啟動和維持了CD中的異常獲得性免疫反應。人類腸道抗菌肽主要由腸道α-防御素及少量的溶菌酶(lysozyme)和分泌型磷脂酶A2(secretory phospholipase A2, sPLA2)組成。它們不僅對G-菌和G+菌有抗菌活性功能,而且對病毒、真菌和寄生蟲也有一定的抗活性功能。人類腸道α-防御素有兩種,即人類α-防御素5和6(human a-defensin 5和6,HD-5和HD-6),它們不但是人類腸道抗菌肽的主要組成成分,而且許多實驗已經(jīng)證實它們在腸道的固有免疫中起到了非常重要的作用。例如,轉基因小鼠在促腸道α-防御素成熟的酶缺失后,它們不但容易被鼠傷寒沙門氏菌感染,而且它們的腸道微生物組成也會發(fā)生明顯的改變,而HD5轉基因小鼠則能增強他們的抗鼠傷寒沙門氏菌感染能力和有顯著的腸內節(jié)絲狀菌的缺失,而HD6轉基因小鼠則能保護他們免受許多腸道病原菌的黏附侵入。白介素-23(Interleukin-23,IL-23)是一種由IL-23p19和IL-12p40組成的異二聚體類細胞因子。目前認為IL-23p19是IL-23特異的的組成亞單位,而IL-12p40還是IL-12的組成亞單位。在IL-23被認識之前,IL-12常被認為是腸道炎癥反應中至關重要的細胞因子。但是近年來許多研究表明IL-23才是在腸道炎癥反應中起著至關重要作用的細胞因子,例如,利用IL-23敲除小鼠進行的研究表明引起腸道內炎癥因子聯(lián)級反應的重要細胞因子是IL-23而不是IL-12,這類炎癥因子主要包括IL-17、TNFα、IFNy和IL-6等；利用IBD病人腸道黏膜組織進行的研究表明IL-23通過啟動兩條重要的促炎通路參與IBD的發(fā)病,它們就是CD中的IL-23/Thl通路和UC中的IL-23/Th1 7通路；利用轉基因小鼠進行的研究表明IL-23p19過表達會導致包括腸道在內的多器官的炎癥發(fā)生；利用封閉性抗IL-23p19的單克隆抗體進行的研究表明封閉處理IL-23p19蛋白能顯著改善小鼠因IL-10缺失引起的自發(fā)性腸炎和菌感染引起的Thl7細胞介導的結腸炎。這些研究表明在腸道炎癥反應中IL-23p19起到了至關重要的作用。NOD2是第一個被認識的CD易感基因,研究表明在西方人群中超過50%的CD病人有NOD2突變體的存在。有研究表明在生理條件下潘氏細胞表達一定量的NOD2,而在CD這種病理條件下潘氏細胞過表達NOD2。也有研究表明這類細胞的IL-23p19基因表達也存在類似情況,即在生理條件下適度表達而在CD病理條件下過表達。目前還不清楚IL-23p19基因的這種類似的表達現(xiàn)象是否由于NOD2的表達異常而造成的。另有研究表明健康人回腸末段有一定量的抗菌肽表達,而在CD病人回腸末段抗菌肽的表達量減少,特別是α-防御素的表達量減少更明顯,在NOD2有突變的CD病人中,此部位的α-防御素的表達量則進一步減少。盡管這些研究結果提示NOD2可能同人類腸道抗菌肽的表達有某種關系,但是目前人們對NOD2在人類腸道抗菌肽表達中具體作用的認知還非常有限。因為潘氏細胞在體外培養(yǎng)條件下不能存活,所以體外實驗探討潘氏細胞內NOD2功能時就有必要找到一種合適的替代細胞系。有研究顯示Caco2腸上皮細胞在體外培養(yǎng)時有向小腸上皮分化的功能,這些研究表明這類細胞似乎有潛在的腸干細胞的功能。此外,這類細胞還表達豐富的纖維母細胞生長因子受體-3(fibroblast growth factor receptor-3,FGFR-3),已證實在腸道發(fā)展過程中這種受體對潘氏細胞的分化起到了關鍵的調節(jié)作用。更重要的是這類細胞還能表達一定量的NOD2。因此,它是一種比較合適的可替代潘氏細胞進行體外實驗探討NOD2功能的細胞。基于以上的研究背景,本研究有以下目的：1、活化FGFR-3介導的信號能否體外誘導Caco2細胞向潘氏細胞系分化。2、在潘氏細胞系分化過程中NOD2是否調節(jié)人類腸道抗菌肽的表達。3、研究NOD2調節(jié)腸道α-防御素表達的作用及機制。4、研究NOD2調節(jié)IL-23p19表達的作用及機制。方法1、用傳代在15-30之間處于對數(shù)生長期的Caco2細胞進行實驗。為了更好地模擬腸上皮細胞在體內腸道的空間位置條件,我們把Caco2細胞種植在置于六孔板內的懸掛式培養(yǎng)小室的PET膜上(3 μm pore size),這種膜允許培養(yǎng)基自由通過而進入膜的上下兩邊,而不允許細胞通過。2、為研究體外誘導Caco2細胞是否向潘氏細胞系分化,我們用10 ng/ml纖維母細胞生長因子9(fibroblast growth factor 9, FGF9)刺激Caco2細胞,FGF9是一種最有親和力的FGFR-3配體。每24 h換一次刺激液體,連續(xù)刺激72 h后終止刺激并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測SI和APOA1這兩種吸收腸上皮細胞分化特異基因的mRNA表達量和HD5、HD6、lysozyme和sPLA2這四種潘氏細胞分化特異基因的mRNA表達量。3、為研究NOD2是否調節(jié)人類腸道抗菌肽的表達,我們用10μg/ml胞壁酰二肽(muramyl dipeptide, MDP)刺激Caco2細胞,MDP是NOD2的配體；用10 ng/ml FGF9刺激Caco2細胞；用10 μg/ml MDP+10 ng/ml FGF9刺激Caco2細胞,每24 h換一次相同的刺激液體,連續(xù)刺激72 h后終止刺激并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測HD5、HD6、lysozyme和sPLA2這四種潘氏細胞分化特異基因,也是人類腸道抗菌肽基因的mRNA表達量。為進一步從反面證實NOD2在調節(jié)人類腸道抗菌肽表達中的作用,我們先向Caco2細胞轉染NOD2-siRNA以敲低細胞內的NOD2蛋白,再分別用10 μg/ml MDP、10 ng/mlFGF9和10 μg/ml MDP+10 ng/ml FGF9刺激完成轉染的細胞,每24 h換液一次,連續(xù)刺激72 h終止并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測HD5、HD6、 lysozyme和sPLA2的mRNA表達量和進行Western blot實驗檢測HD5和HD6的蛋白表達量。4、為研究誘導分化過程中NOD2的表達是否受到影響,我們用10 ng/mlFGF9刺激Caco2細胞,每24 h換一次刺激液體,分別于刺激24 h、48 h和72h后終止刺激并收集細胞進行Western blot實驗檢測NOD2的蛋白表達量。5、為研究誘導人類腸道α-防御素表達過程中可能參與的信號通路,我們分別用10 μg/ml MDP和10 ng/ml FGF9刺激Caco2細胞,每24 h換一次相同的刺激液體,連續(xù)刺激72 h終止刺激。而在最后一次24 h刺激前,我們先用5μM、10μM和50μM三種濃度的信號通路抑制劑,即NF-κB通路抑制劑BAY117082、PI3K通路抑制劑LY294002、MAPK信號通路的p38抑制劑SB203580、ERK1/2抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125處理細胞30 min,接著再用10 μg/ml MDP或10 ng/ml FGF9刺激細胞24 h后終止刺激并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測HD5和HD6的mRNA表達量。6、為研究主導人類腸道抗菌肽表達的信號通路的活化情況,我們用10ng/ml FGF9刺激Caco2細胞,分別于刺激10 min、30 min、60 min和120 min后收集細胞進行Western blot實驗檢測主導信號通路蛋白的磷酸化情況。7、為研究NF-κB通路哪種轉錄因子傳到胞漿MDP-NOD2信號進胞核,我們用10 μg/ml MDP刺激Caco2細胞,分別于刺激2h、4h和6 h后終止刺激并收集細胞進行轉錄因子NF-κB活化量的檢測實驗。8、為得到類潘氏細胞,我們用10 ng/ml FGF9連續(xù)刺激Caco2細胞72 h,每24 h換一次刺激液體。這樣處理得到的細胞用作類潘氏細胞,我們用這種類潘氏細胞來體外研究NOD2調節(jié)IL-23p19表達的作用及機制。9、為研究哪種腸道微生物成分誘導IL-23p19的表達,我們用各種工作濃度的TLRs配體,即10 μg/ml PGN、1 μg/ml Pam3CSK4,10 μg/ml Poly (I:C)、 10 μg/ml LPS,1μg/ml Flagellin,1μg/ml FSL-1、1μg/ml Imiquimod,1μg/ml ssRNA40和1μM MODN2006來刺激類潘氏細胞,分別于刺激4h、8h和16h后終止刺激并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測IL-23p19 mRNA的表達量。10、為研究NOD2是否調節(jié)TLR2介導的IL-23p19的表達,我們分別用10μg/ml MDP、10 μg/ml PGN、10μg/ml PGN+10 μg/ml MDP、1μg/ml Pam3CSK4和1 μg/ml Pam3CSK4+10μg/ml MDP刺激類潘氏細胞,于刺激4h后終止刺激并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測IL-23p19 mRNA的表達量。為了進一步從反面證實NOD2在調節(jié)TLR2介導的IL-23p19的表達中的作用,我們先用NOD2-siRNA敲低細胞內的NOD2蛋白,再用10 μg/ml PGN、1 μg/ml Pam3CSK4和1 μg/ml Pam3CSK4+10 μg/ml MDP分別刺激4h后收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測IL-23p19 mRNA的表達量,在PGN刺激4h后還收集細胞進行Western blot實驗檢測IL-23p19蛋白的表達量。11、為了研究TLR2介導的IL-23p19表達主要涉及到哪些信號通路,我們先用五種工作濃度的信號通路抑制劑,即50 μM BAY117082 (NF-κB),50 μM LY294002 (PI3K),50μM SB203580 (p38),50 μM U0126 (ERK1/2), and 50μMSP600125 (JNK)預處理類潘氏細胞30 min,再用10μg/ml PGN刺激細胞4h后終止刺激并收集細胞進行實時定量PCR實驗檢測IL-23p19 mRNA的表達量。12、為研究主導IL-23p19表達的信號通路之活化情況,我們用10 μg/mlPGN刺激類潘氏細胞,分別于刺激5 min、10 min、30 min和60 min后收集細胞進行Western blot實驗檢測相關信號通路蛋白的磷酸化情況。13、為研究NF-κB通路哪種轉錄因子傳導引起IL-23p19表達的胞漿信號進胞核,我們用1μg/ml Pam3CSK4和10μg/ml PGN刺激類潘氏細胞,于刺激2h后終止刺激并收集細胞進行轉錄因子NF-κB活化量的檢測實驗。14、為研究TLR2配體Pam3CSK4和PGN誘導IL-23p19表達差異的機制,我們用先用NOD2-siRNA敲低細胞內的NOD2蛋白,再用10μg/ml PGN刺激2h后收集細胞進行轉錄因子NF-κB活化量的檢測實驗。15、計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。應用SPSS 18.0軟件進行分析。兩組間比較時采用Student's t檢驗；多組間比較時采用單因素方差分析(one-way ANOVA),當滿足方差齊性時,用Tukey法行組間多重比較,當方差不齊時,用Dunnett T3法行組間多重比較。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1、在FGF9連續(xù)刺激Caco2細胞72小時后,同未處理組相比,處理組的SI和APOA1這兩種吸收腸上皮細胞分化特異基因的mRNA表達量均顯著減少且維持至少72小時。相反,處理組的四種潘氏細胞分化特異基因HD5、HD6、lysozyme和sPLA2的mRNA表達量卻顯著地增加并維持至少24小時。2、同僅用FGF9連續(xù)刺激細胞72小時相比,用FGF9+MDP連續(xù)刺激Caco2細胞72小時后,HD5、HD6、lysozyme和sPLA2的mRNA表達量分別減少約10.6倍、9.6倍、2.7倍和2.3倍。而在轉染NOD2-siRNA后,FGF9刺激的轉染細胞同未轉染細胞相比,HD5、HD6、lysozyme和sPLA2的mRNA表達量均顯著增加。同此結果相一致,FGF9刺激的轉染細胞同未轉染細胞相比,HD5和HD6蛋白表達量也都顯著增加。3、在MDP連續(xù)刺激Caco2細胞72小時后,同未處理組相比,處理組的HD5和HD6基因的mRNA表達量分別增加約2.8倍和1.5倍,但是處理組的lysozyme和sPLA2基因的：mRNA表達量卻沒有顯著性的改變。而在轉染NOD2-siRNA后,MDP刺激的轉染細胞同未轉染細胞相比,HD5和HD6的mRNA表達量均顯著減少。4、FGF9刺激組同未處理組間的NOD2蛋白表達并沒有顯著性的差異。5、MDP刺激的信號通路抑制劑預處理的細胞同未預處理的細胞相比,在用BAY117082預處理的細胞中HD5和HD6的mRNA表達量均減少最明顯。而FGF9刺激的預處理細胞同未預處理的細胞相比,HD5和HD6的mRNA表達量分別在用SP600125和SB203580預處理的細胞中減少最明顯。另外,FGF9刺激能引起Caco2細胞內MAPK通路中三種激酶p38、JNK和ERK1/2的磷酸化。6、在MDP刺激4小時和6小時后,胞核蛋白中p52,p50, Re1B和c-Rel的活化量都顯著性增加,其中增加最明顯的是p52和p50的活化量。7、TLR2激動劑PGN和Pam3CSK4均可以誘導類潘氏細胞的IL-23p19表達,當刺激處理4小時后,兩者誘導的IL-23pl9 mRNA表達量最多,且此時PGN誘導的IL-23p19 mRNA表達量是Pam3CSK4誘導的四倍。此外,除了TLR2的激動劑PGN和Pam3CSK4外,其它的TLR激動劑并不能顯著性誘導IL-23p19的表達。8、同PGN刺激細胞比,PGN+MDP刺激細胞的IL-23p19 mRNA表達量顯著增加；同Pam3CSK4刺激組比,Pam3CSK4+MDP刺激組的IL-23p19mRNA表達量也顯著增加。此外,單獨用MDP刺激并不能顯著性誘導IL-23p19的mRNA表達。而在轉染NOD2-siRNA后,PGN或Pam3CSK4+MDP刺激的轉染細胞同未轉染組細胞相比,IL-23p19的mRNA表達量顯著減少,而Pam3CSK4刺激的轉染細胞同未轉染細胞相比,IL-23p19的mRNA表達量并無顯著性差異。另外,在Pam3CSK4刺激的未轉染細胞同PGN刺激的轉染細胞之間IL-23p19的mRNA表達量并無顯著性差異。此外,PGN刺激的轉染細胞同未轉染細胞相比,IL-23p19的蛋白表達量顯著減少。9、PGN刺激的用信號通路抑制劑預處理的細胞同未預處理的細胞相比,IL-23p19 mRNA表達量顯著減少,而在用BAY117082預處理的細胞中IL-23p19 mRNA表達量減少最明顯。此外,PGN還能引起IκBα的磷酸化。10、同未用任何刺激的對照組相比,NF-κB亞單位c-Rel的活化量在用PGN和Pam3CSK4刺激后均顯著增加,而其它亞單位p65、p52、p50和RelB的活化量都沒有顯著性的差異改變。此外,同Pam3CSK4刺激組相比,PGN刺激組的c-Rel的活化量顯著性增加。而在轉染NOD2-siRNA后,PGN刺激的轉染組同未轉染組相比c-Rel的活化量顯著性減少,而同Pam3CSK4刺激的未轉染組相比c-Rel的活化量卻沒有顯著性差異。結論1、活化FGFR-3介導的信號能體外誘導Caco2細胞向潘氏細胞系分化。2、在潘氏細胞系分化過程中NOD2下調人類腸道抗菌肽的表達。3、雖然僅活化NOD2本身能輕微上調人類腸道α-防御素的表達,但它卻能顯著下調FGFR-3介導的人類腸道α-防御素的表達。NOD2分別通過NF-κB通路和MAPK通路來上調和下調人類腸道α-防御素的表達。4、NOD2通過NF-κB亞單位c-Rel上調TLR2介導的IL-23p19的表達。
【關鍵詞】：克羅恩病 NOD2 人類腸道抗菌肽 人類腸道 α-防御素 白介素-23
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 第一章 在潘氏細胞系的分化過程中NOD2下調人類腸道抗菌肽的表達22-74
• 1.1 引言22-24
• 1.2 材料和方法24-52
• 1.3 實驗結果52-69
• 1.4 討論69-74
• 第二章 在類潘氏細胞中NOD2通過NF-κB亞單位c-Rel上調TLR2介導的IL-23p19表達74-102
• 2.1 引言74-76
• 2.2 材料和方法76-88
• 2.3 實驗結果88-99
• 2.4 討論99-102
• 全文小結102-103
• 參考文獻103-117
• 中英文縮寫詞對照表117-118
• 攻讀學位期間成果118-119
• 致謝119-121
• 統(tǒng)計學證明121

  本文關鍵詞：NOD2對潘氏細胞系抗菌肽和白介素-23pl9表達的調節(jié)作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：279996