本文關(guān)鍵詞：鈉尿肽嵌合體C_NAA_C的篩選及其抗慢性心力衰竭作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是因?yàn)樾募p傷(或病變)和心室長期壓力或容量負(fù)荷過重,引起心肌收縮力受損,從而導(dǎo)致心室充盈(或)射血能力受損而引起的一組綜合征。心肌發(fā)生損傷后,交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(rennin angiotensin aldosterone system,RAAS)興奮,使多種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌因子激活,促進(jìn)心肌重構(gòu)的發(fā)生,這進(jìn)一步加重了心肌損傷并使心功能惡化,從而形成了惡性循環(huán)。盡管近年來對心力衰竭(heart failure,HF)發(fā)病機(jī)制和臨床防治的研究取得了較大進(jìn)展,但HF導(dǎo)致的死亡人數(shù)仍然逐年升高,成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生和社會問題。因此,對HF的研究亟待尋求新的突破,為推動HF的防治提供新的思路和理論基礎(chǔ)。鈉尿肽(natriuretic peptides,NPs)家族的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了心臟內(nèi)分泌學(xué)的新領(lǐng)域,其在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理及病理生理學(xué)調(diào)節(jié)作用。隨著研究的不斷深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)NPs不僅具有利鈉、利尿和舒血管作用,還具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生理和藥理學(xué)效應(yīng)。如今NPs已成為HF臨床診斷、預(yù)后和治療的明星分子。特別是針對NPs進(jìn)行不同改構(gòu)而獲得的新型鈉尿肽類藥物如心活素等已被臨床應(yīng)用于HF的治療,取得了滿意的效果。NPs分子是由羧基端、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和氨基端三部分組成的多肽結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)的羧基端的5個氨基酸殘基在利尿方面起到重要作用,而環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能與受體結(jié)合及產(chǎn)生舒血管等作用有關(guān)。因此我們把ANP的羧基端進(jìn)行了保留,同時與天然NPs分子ANP、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)和C-型鈉尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和氨基端進(jìn)行不同的組合,設(shè)計(jì)出所有可能結(jié)構(gòu)組合的7種新型NPs嵌合體,通過與ANP、CNP和VNP的舒血管活性進(jìn)行比較,初步篩選出活性相對較強(qiáng)的4種NPs嵌合體:ANCAC、BNAAC、BNBAC、CNAAC。進(jìn)一步通過對4種NPs嵌合體分子的舒血管效應(yīng)進(jìn)行對比,篩選出活性最強(qiáng)的分子為CNAAC并將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)以觀察其在抗HF中的作用,具體研究內(nèi)容為:以ANP、CNP和VNP作為對照,1.應(yīng)用離體血管環(huán)灌流實(shí)驗(yàn),研究CNAAC對大鼠腹主動脈的舒張作用及可能機(jī)制;2.采用整體動物實(shí)驗(yàn),觀察CNAAC對大鼠血流動力學(xué)、尿量、尿c GMP及血c GMP水平等指標(biāo)的影響;3.建立大鼠慢性缺血性HF模型,觀察CNAAC對HF大鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能、相關(guān)體液因子和蛋白表達(dá)的影響。本研究旨在闡明新型NPs嵌合體分子在抗HF中的作用,為臨床應(yīng)用新型NPs嵌合體分子預(yù)防和治療HF提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:研究4種新型NPs嵌合體的舒血管作用,并篩選出活性最強(qiáng)的NPs嵌合體分子;探討活性最強(qiáng)的NPs嵌合體的舒血管作用的可能機(jī)制;整體動物研究其利尿和降壓作用以及在抗HF中的作用。方法:1.采用離體血管環(huán)灌流技術(shù),對7種NPs嵌合體進(jìn)行初步篩選;觀察篩選出的4種NPs嵌合體分子對大鼠離體腹主動脈血管環(huán)的舒張作用,篩選出活性最強(qiáng)的NPs嵌合體。2.采用離體血管環(huán)灌流技術(shù),檢測抗NPR-A抗體ab14356、非特異性鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase,GC)抑制劑鎂藍(lán)(methylene blue,MB)、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase,s GC)抑制劑ODQ、c GMP依賴性蛋白激酶(c GMP-dependent protein kinase,PKG)的抑制劑KT 5823、NO合酶(nitric oxide sythase)抑制劑L-NAME(NG-Nitro-L-arginine methyl ester,hydrochloride)、ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)阻斷劑格列苯脲(glybenclamide,Gly)、鈣依賴性鉀離子通道(Ca2+dependent potassium channel,KCa)阻斷劑四乙胺(tetraethylammonium chloride,TEA)對CNAAC舒血管作用的影響。3.測定給予ANP、CNP、VNP或CNAAC孵育后,離體腹主動脈在不同時間點(diǎn)分泌c GMP的水平,以探討NPs舒張血管作用與GC/c GMP信號通路的關(guān)系。4.大鼠頸靜脈注射ANP、CNP、VNP或CNAAC(50μg/kg)后記錄血流動力學(xué)指標(biāo),收集尿液和血液,檢測尿量及尿c GMP和血c GMP的水平。5.采用三種不同的HF造模方法:腹主動脈狹窄法、冠脈結(jié)扎法以及(腹主動脈狹窄+冠脈結(jié)扎)法,并通過觀察不同造模組大鼠的一般機(jī)體指標(biāo)、心臟/體重比(heart weight/body weight ratio,HW/BW)、血流動力學(xué)、超聲心動圖和病理學(xué)切片等指標(biāo),以選取效果最好的方法進(jìn)行HF造模實(shí)驗(yàn)。6.HF造模當(dāng)天開始腹腔注射ANP、CNP、VNP或CNAAC(20 nmol/kg/2d),持續(xù)注射4周后進(jìn)行一般體征指標(biāo)觀察,對心臟、肺臟進(jìn)行稱重,記錄超聲心動圖和血流動力學(xué)指標(biāo),觀察NPs對HF大鼠心臟功能的影響。7.采用離體血管環(huán)灌流技術(shù),檢測CNAAC對HF大鼠離體腹主動脈的舒張作用。8.蘇木素-伊紅(hematoxylin eosine,HE)染色法和Masson染色法(Masson’s trichrome stain)觀察心肌損傷和測定ANP、CNP、VNP和CNAAC對大鼠心肌梗死面積(infarct size,IS)和心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)的影響。9.Elisa試劑盒檢測各組大鼠血清中BNP、Ang II、ALD、ET-1、c GMP、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平的變化。10.Western blotting檢測各組大鼠左心室鈉尿肽受體A(natriuretic peptide receptor A,NPR-A)和鈉尿肽受體C(natriuretic peptide receptor C,NPR-C)的表達(dá)情況。結(jié)果:1.經(jīng)過初步篩選,從7種NPs嵌合體分子中得到了4種活性相對較強(qiáng)的NPs嵌合體:ANCAC、BNAAC、BNBAC和CNAAC,這4種嵌合體均可以劑量依賴性的舒張大鼠的腹主動脈,其舒張效應(yīng)由強(qiáng)至弱依次為:CNAACBNAACANCACBNBAC;我們將CNAAC與ANP、CNP及VNP的舒血管作用進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)CNAAC具有優(yōu)于其他三種NPs的舒張效應(yīng),舒張效應(yīng)由強(qiáng)至弱依次為CNAACVNP≥ANPCNP,因此我們選取CNAAC作為研究對象進(jìn)行后續(xù)研究。2.CNAAC可以劑量依賴性的舒張大鼠的離體腹主動脈;CNAAC的舒張作用可被NPR-A抗體ab14356(1:1000)、GC的抑制劑MB(10-5 M)、s GC的抑制劑ODQ(10-5M)、KATP的阻斷劑Gly(10-6 M)、KCa的阻斷劑TEA(10-3 M)顯著減弱,被PKG抑制劑KT5823(10-5M)完全阻斷;而NO合酶抑制劑L-NAME(10-4M)對CNAAC引起的舒張作用沒有顯著影響,在去內(nèi)皮組和保留內(nèi)皮組其舒張作用沒有明顯差異。3.在不同的時間點(diǎn),10-6 M的NPs均可以引起血管釋放c GMP。CNAAC在孵育血管5 min、15 min及30 min時引起的c GMP釋放量均明顯高于ANP、CNP或VNP,且CNAAC引起的c GMP釋放具有時間依賴性。提前給予ODQ處理后,CNAAC引起的c GMP釋放量明顯減少。4.靜脈注射ANP、VNP和CNAAC后,大鼠尿量均明顯增加,但靜脈注射CNP后,尿量未見明顯增加,利尿作用由強(qiáng)至弱為:CNAACANP≥VNPCNP;靜脈注射ANP、CNP、VNP和CNAAC后,大鼠的平均動脈壓均明顯降低,其尿c GMP和血漿c GMP水平均明顯增加。5.整體實(shí)驗(yàn)中,選用缺血性HF模型,各給藥組在大鼠冠脈結(jié)扎當(dāng)天開始給予腹腔注射ANP、CNP、VNP或CNAAC(20nmol/kg/2d,4 weeks)。CNAAC仍然可以劑量依賴性的舒張HF大鼠的離體腹主動脈,且與內(nèi)皮無關(guān)。6.與對照組相比,HF組大鼠精神萎靡,毛色暗黃,活動度、飲食飲水減少,HW/BW、肺臟/體重比(pulmonary weight/body weight ratio,PW/BW)增高;與HF組相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可改善大鼠的一般體征指標(biāo)、明顯降低大鼠的HW/BW,僅VNP和CNAAC可顯著降低大鼠的PW/BW;血流動力學(xué)指標(biāo)檢測顯示:與對照組相比,HF組大鼠LVSP和±dp/dtmax明顯下降、LVEDP明顯上升;與HF組相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯改善大鼠的LVSP、LVEDP和±dp/dtmax;超聲心動圖檢測顯示:與對照組相比,HF組大鼠左室前壁搏動幅度變?nèi)?室腔擴(kuò)大;與HF組相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯改善大鼠的EF、FS、LVEDV和LVESV,但只有CNAAC可明顯改善大鼠的LVEDD和LVESD,且CNAAC對LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV的改善作用明顯優(yōu)于ANP、CNP或VNP。7.HE染色顯示:對照組心肌排列整齊,心肌橫紋清楚,未見明顯心肌梗死;HF組和各給藥組呈現(xiàn)顯著的心肌梗死,出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤,梗死區(qū)纖維化嚴(yán)重。Masson染色顯示:對照組心室腔、室間隔正常;HF組和各給藥組左室壁變薄、蒼白,室間隔增厚,出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維。與HF組相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯減少心肌IS和CVF;其中CNAAC和VNP對IS的改善作用明顯優(yōu)于ANP和CNP,而且CNAAC對CVF的改善作用明顯優(yōu)于其他各組。8.與對照組相比,HF組大鼠血清中BNP、Ang II、ALD和ET-1的水平均明顯增高;與HF組相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯降低大鼠血清中Ang II和ET-1的水平;但僅有VNP和CNAAC可明顯降低大鼠血清中的BNP水平,僅有ANP、VNP和CNAAC可顯著降低大鼠血清中ALD的水平。與對照組相比,HF組大鼠血清中c GMP的水平明顯降低,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯增高大鼠血清中c GMP的水平。9.與對照組相比,HF組大鼠血清中炎癥因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的水平均明顯升高;與HF組相比,ANP、CNP和CNAAC可明顯降低大鼠血清IL-1α的水平;ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明顯降低大鼠血清IL-6的水平;僅CNAAC可明顯降低大鼠血清IL-8和TNF-α的水平,CNAAC對大鼠血清IL-8和TNF-α的水平的降低作用優(yōu)于其他三種NPs;血清IL-10水平在各組之間沒有顯著性變化。10.與對照組相比,HF組大鼠心臟的NPR-A表達(dá)量明顯減少;與HF組相比,ANP、VNP和CNAAC可明顯增加NPR-A的表達(dá)量,相互間沒有明顯差異,但CNP對NPR-A表達(dá)量的影響遠(yuǎn)低于ANP。與對照組相比,HF組大鼠心臟的NPR-C表達(dá)量明顯增加;與HF組相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均明顯降低NPR-C的表達(dá)量。相互間沒有明顯差異。結(jié)論:1.本研究將ANP羧基端與不同天然NPs的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和氨基端進(jìn)行組合,設(shè)計(jì)并合成了具有生物活性的7種NPs嵌合體分子,經(jīng)過篩選獲得了ANCAC、BNAAC、BNBAC和CNAAC等4種NPs嵌合體分子均具有劑量依賴性的舒張血管作用,其舒張效應(yīng)由強(qiáng)至弱依次為:CNAACBNAACANCACBNBAC;其中CNAAC可以劑量依賴性、非內(nèi)皮依賴的舒張大鼠的腹主動脈,其舒張作用可能與NPR-A/s GC/PKG通路有關(guān),KATP和KCa可能是CNAAC舒張作用的重要效應(yīng)分子。2.靜脈注射CNAAC具有顯著的利尿和降壓作用,c GMP可能參與了其上述過程。3.腹腔注射CNAAC可以顯著改善HF大鼠的左室收縮和舒張功能,減輕HF時心肌肥厚、肺淤血程度以及心肌梗死和心肌纖維化的發(fā)生,并抑制多種體液因子和炎癥因子水平的異常升高,增加NPR-A的表達(dá),減少NPR-C的表達(dá)�？傊�,CNAAC具有顯著的改善心臟功能、利尿、舒張血管等效應(yīng),提示其可能將在CHF的預(yù)防和治療中有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：新型鈉尿肽 心臟功能 舒血管作用 利尿作用 慢性心力衰竭
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R541.6
【目錄】：

• 縮略語表7-11
• 中文摘要11-17
• ABSTRACT17-24
• 前言24-26
• 文獻(xiàn)回顧26-46
• 第一部分 新的NPS嵌合體分子的篩選及舒張血管作用的研究46-64
• 1 材料46-48
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物46
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑46-47
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器47-48
• 1.4 主要試劑配制48
• 2 方法48-50
• 2.1 NPs嵌合體分子舒血管作用的研究方法48-49
• 2.2 NPs嵌合體分子與天然NPs舒血管作用的比較方法49
• 2.3 NPs嵌合體舒血管機(jī)制的研究方法49
• 2.4 NPs嵌合體對腹主動脈分泌c GMP影響的測定49-50
• 2.5 NPs嵌合體舒張作用的內(nèi)皮依賴性測定50
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理50
• 3 結(jié)果50-60
• 3.1 NPs嵌合體分子的篩選結(jié)果50-53
• 3.2 C_NAA_C與ANP、CNP及VNP舒血管作用的比較53-54
• 3.3 C_NAA_C舒血管作用的機(jī)制54-58
• 3.4 NPs對離體大鼠腹主動脈釋放c GMP的影響58-60
• 3.5 血管內(nèi)皮對C_NAA_C舒血管作用的影響60
• 4 討論60-64
• 第二部分 C_NAA_C的利尿作用研究64-71
• 1 材料64-65
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物64
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑64
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器64-65
• 2 方法65-67
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組65
• 2.2 去膀胱導(dǎo)尿法收集大鼠尿液65-66
• 2.3 大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)和尿量的測定66-67
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理67
• 3 結(jié)果67-69
• 3.1 NPs對大鼠尿量的影響67-68
• 3.2 NPs對大鼠尿c GMP及血c GMP水平的影響68-69
• 3.3 NPs對大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的影響69
• 4 討論69-71
• 第三部分 C_NAA_C抗CHF作用的研究71-102
• 【實(shí)驗(yàn)一】 HF動物模型的建立71-80
• 1 材料71-73
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物71
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑71-72
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器72
• 1.4 主要試劑配制72-73
• 2 方法73-75
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理73
• 2.2 三種HF模型的建立方法73-74
• 2.3 超聲心動圖檢查74
• 2.4 大鼠血流動力學(xué)及心臟/體重比的測定74
• 2.5 心肌組織病理學(xué)檢測74
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理74-75
• 3 結(jié)果75-78
• 3.1 存活率與一般體征指標(biāo)觀察75
• 3.2 心臟/體重比75-76
• 3.3 心臟超聲心動圖檢查結(jié)果76-77
• 3.4 血流動力學(xué)指標(biāo)77-78
• 3.5 心肌組織的病理學(xué)改變78
• 4 討論78-80
• 【實(shí)驗(yàn)二】 C_NAA_C在抗CHF中的作用80-102
• 1 材料80-84
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物80
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑80-82
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器82-83
• 1.4 主要試劑配制83-84
• 2 方法84-87
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理84
• 2.2 C_NAA_C對HF大鼠腹主動脈舒張作用的研究方法84
• 2.3 C_NAA_C舒張HF大鼠腹主動脈作用內(nèi)皮依賴性測定84-85
• 2.4 心功能測定85
• 2.5 心臟/體重比和肺臟/體重比的測定85
• 2.6 心肌梗死面積及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)測定85-86
• 2.7 大鼠血清BNP、Ang II、ALD、ET-1、c GMP、IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10水平的測定86
• 2.8 蛋白表達(dá)變化的Western Blot檢測86-87
• 2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理87
• 3 結(jié)果87-98
• 3.1 存活率及一般體征指標(biāo)觀察87-88
• 3.2 C_NAA_C對HF大鼠腹主動脈的舒張作用88-89
• 3.3 內(nèi)皮對C_NAA_C舒血管作用的影響89
• 3.4 心臟/體重比和肺臟/體重比89-90
• 3.5 血流動力學(xué)指標(biāo)90
• 3.6 心臟超聲心動圖檢查結(jié)果90-92
• 3.7 C_NAA_C對HF大鼠心肌梗死面積和膠原容積分?jǐn)?shù)的影響92-94
• 3.8 C_NAA_C對大鼠血清中體液因子水平的影響94-97
• 3.9 C_NAA_C對NPR-A和NPR-C蛋白表達(dá)的影響97-98
• 4 討論98-102
• 小結(jié)102-103
• 參考文獻(xiàn)103-120
• 個人簡歷和研究成果120-121
• 致謝121

  本文關(guān)鍵詞：鈉尿肽嵌合體C_NAA_C的篩選及其抗慢性心力衰竭作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：277279