本文關(guān)鍵詞：對不同WGA方法的評估及拷貝數(shù)變異測序技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中的臨床轉(zhuǎn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)/胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening,PGS)是在輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive techniques,ART)時,針對于有特定遺傳疾病風(fēng)險的夫婦,對體外受精(in-vitro fertilization,IVF)胚胎進行活檢,采用多種技術(shù)進行遺傳學(xué)診斷,以選擇正常胚胎進行移植,提高臨床妊娠率和臨床分娩率,降低流產(chǎn)率,是輔助生殖技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合而形成的一種產(chǎn)前診斷技術(shù)。PGS是對植入前的胚胎進行染色體非整倍進行檢測,目前所用的PGD/PGS技術(shù)有聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR),熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH),全基因組擴增技術(shù)(whole genome amplification,WGA),比較基因組雜交芯片(comparative genomic hybridization arrays,a CGH),單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism arrays,SNP),二代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology,NGS)等。WGA是一種能對微量甚至是極微量DNA進行有效擴增的技術(shù),其擴增產(chǎn)物可被多種常規(guī)分子技術(shù)用于下游的遺傳學(xué)分析。盡管現(xiàn)有多種被優(yōu)化的WGA技術(shù),但本質(zhì)上都可歸于擴增前引物延伸反應(yīng)(Primer extension preamplification,PEP)、簡并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligonucleotide primer PCR,DOP-PCR)和多重置換擴增(Multipledis-placement amplification,MDA)[1]這三種方法。WGA技術(shù)已在臨床廣泛應(yīng)用,如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基因分型[2],法醫(yī)樣本的鑒定,PGD/PGS胚胎的染色體和單基因病的基因分析等。通過ART所獲得的胚胎發(fā)生染色體異常的可能性較高,這是導(dǎo)致胚胎植入失敗、孕早期胎停育及自發(fā)性流產(chǎn)的重要原因。在PGD/PGS領(lǐng)域,a CGH和SNP芯片因能夠檢測胚胎24條染色體且具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性,而被廣泛應(yīng)用于鑒別整倍體與非整倍體胚胎[3,4]。無論是芯片技術(shù)還是NGS平臺,都依賴于WGA技術(shù)這一關(guān)鍵步驟將胚胎活檢樣本的微量DNA高保真擴增,產(chǎn)生的足量DNA能夠用于芯片的雜交或NGS的建庫。關(guān)于WGA技術(shù)在PGD/PGS領(lǐng)域的應(yīng)用多有研究,但是基于現(xiàn)有NGS平臺,針對于不同WGA技術(shù)在PGD/PGS領(lǐng)域應(yīng)用的橫向研究未見報道。在PGD/PGS的臨床實踐中,a CGH和SNP芯片在染色體異常的檢測方面顯現(xiàn)出較高的可靠性和準(zhǔn)確性。但是,現(xiàn)有的商業(yè)化的芯片平臺在探針設(shè)計、探針定制以及染色體探針密度分布方面存在顯著不同,此外,某些平臺因檢測分辨率較低難以檢測出具有顯著臨床意義的IVF胚胎染色體異常。另外,SNP芯片在檢測染色體三體和其它由于未減數(shù)分裂重組導(dǎo)致的染色體重復(fù)方面也存在不足。在臨床實踐中,從胚胎樣本活檢到出具檢測報告,芯片平臺工作流程繁瑣,且需對DNA進行標(biāo)記、雜交。因芯片及相關(guān)試劑費用高昂,探針數(shù)量有限等客觀因素,致使芯片檢測效率較低。而NGS結(jié)合強有效的生物信息學(xué)算法,使對IVF胚胎染色體異常的檢測更加全面且更加經(jīng)濟有效,為PGD/PGS領(lǐng)域的發(fā)展帶來新機遇。我們將NGS技術(shù)與生物信息學(xué)聯(lián)合應(yīng)用開發(fā)出適用于單細(xì)胞PGS分析的高分辨率拷貝數(shù)變異測序技術(shù)(Copy number variation sequencing,CNV-Seq),以解決胚胎活檢樣本的CNV檢測問題,同時將基于PCR的Sure Plex WGA方法引入現(xiàn)有PGS流程,評估其檢測染色體異常的效能,使CNV-Seq的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用成為可能,并有望取代a CGH及SNP芯片在PGS領(lǐng)域的應(yīng)用,對胚胎染色體異常進行精準(zhǔn)檢測。目的1.依托所研發(fā)的CNV-Seq技術(shù)平臺,對三種WGA方法——以PCR為基礎(chǔ)的Sure Plex和MALBAC與以MDA為基礎(chǔ)的REPLI-g,從擴增覆蓋度、敏感性、特異性和可重復(fù)性等方面進行對比研究。希望通過我們的研究,將具有擴增優(yōu)勢的WGA方法引入現(xiàn)有的測序流程。2.分別用回顧性研究和雙盲研究,以a CGH為金標(biāo)準(zhǔn),利用CNV-Seq檢測染色體非整倍性和非平衡易位,全面評估其檢測染色體異常的效能,并進一步將CNV-Seq技術(shù)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用至PGS領(lǐng)域。方法1.選取6名具有臨床表型的染色體疾病患者為研究對象,1名正常核型的男性為陰性對照,收集研究對象的外周血,提取基因組DNA(genomic DNA,g DNA),純化后梯度稀釋至15pg,顯微操作從患者的凍融外周血中分離單細(xì)胞,分別在稀釋g DNA單細(xì)胞水平和單細(xì)胞水平,對Sure Plex、MALBAC和REPLI-g三種WGA方法全基因組覆蓋度、敏感性、特異性和可重復(fù)性等方面進行對比研究。2.選取24例經(jīng)a CGH檢測的WGA產(chǎn)物,其中10例WGA產(chǎn)物用于回顧性研究,14例WGA產(chǎn)物用于雙盲研究,我們以a CGH為金標(biāo)準(zhǔn),驗證CNV-Seq在檢測染色體非整倍體和非平衡易位方面的效能,通過直接比較a CGH和CNV-Seq對同一例胚胎單卵裂球活檢的WGA產(chǎn)物的檢測結(jié)果,來驗證CNV-Seq的檢測效能。選擇3對需行PGS檢測的夫婦進行初步的臨床轉(zhuǎn)化。結(jié)果1.從技術(shù)方法、產(chǎn)量、濃度、平均擴增產(chǎn)物長度、所需時間、操作難易程度等方面對Sure Plex、MALBAC和REPLI-g這三種WGA方法進行了比較,Sure Plex和MALBAC在可操作性上確有一定優(yōu)勢。2.Sure Plex和MALBAC這兩種基于PCR的WGA方法較MDA具有更好的基因組覆蓋度、較少的擴增偏倚。3.針對于低起始模板量的DNA,無論是15pg g DNA還是單細(xì)胞,基于PCR的WGA方法在擴增覆蓋度、穩(wěn)定性、敏感性、特異性和可重復(fù)性等方面均優(yōu)于不依賴PCR的MDA技術(shù)。4.回顧性研究和雙盲研究驗證了CNV-Seq在檢測染色體非整倍體和非平衡易位方面的效能,結(jié)果證實CNV-Seq在對染色體CNV的檢測方面具有高準(zhǔn)確率和特異性。5.CNV-Seq初步實現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用,已成功在3對不孕不育夫婦實施,其中一對夫婦在選擇染色體整倍體胚胎植入后分娩一健康女嬰,使不孕不育患者真正受益。結(jié)論1.針對低起始模板量的DNA,無論是稀釋g DNA單細(xì)胞水平還是單細(xì)胞水平,基于PCR的Sure Plex和MALBAC WGA方法在擴增覆蓋度、穩(wěn)定性、敏感性、特異性和可重復(fù)性等方面均優(yōu)于不依賴PCR的REPLI-g MDA技術(shù),聯(lián)合使用CNV-Seq技術(shù)能有效對臨床病理性CNVs做出診斷。2.CNV-Seq在對染色體CNV的檢測方面具有高準(zhǔn)確率和特異性,隨著NGS技術(shù)的迅速發(fā)展,其有望取代a CGH及SNP芯片在PGS領(lǐng)域的應(yīng)用,對胚胎染色體異常進行精準(zhǔn)檢測。
【關(guān)鍵詞】：胚胎植入前遺傳學(xué)篩查 全基因組擴增 二代測序 拷貝數(shù)變異 CNV-Seq 比較基因組雜交芯片
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.8
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-19
• 文獻回顧19-26
• 實驗一 基于二代測序技術(shù)平臺，利用低起始模板量g DNA和單細(xì)胞對不同WGA方法的評估26-58
• 1 材料27-29
• 1.1 主要實驗儀器27-28
• 1.2 通用耗材28
• 1.3 主要實驗試劑28-29
• 2 方法29-44
• 2.1 研究對象與標(biāo)本收集29
• 2.2 g DNA的提取29-30
• 2.3 g DNA的純化30
• 2.4 g DNA純度的檢測30-31
• 2.5 g DNA濃度的測定31
• 2.6 稀釋g DNA樣本的制備31-32
• 2.7 顯微操作分離單細(xì)胞32
• 2.8 WGA32-41
• 2.9 CNV-Seq文庫的構(gòu)建、質(zhì)檢和上機測序41-44
• 3 結(jié)果44-55
• 3.1 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g三種WGA方法一般情況比較44
• 3.2 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g WGA產(chǎn)物凝膠電泳分析44-46
• 3.3 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g WGA產(chǎn)物全基因組覆蓋度對比46-49
• 3.4 Sure Plex和MALBAC WGA產(chǎn)物全基因組覆蓋度穩(wěn)定性的研究49-50
• 3.5 Sure Plex、MALBAC和REPLI-g WGA產(chǎn)物敏感性、特異性和可重復(fù)性的研究 .. 463.6 單細(xì)胞水平驗證Sure Plex50-53
• 3.6 單細(xì)胞水平驗驗證 Sure Plex53-55
• 4 討論55-58
• 實驗二 拷貝數(shù)變異測序技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)診斷中的臨床轉(zhuǎn)化研究58-84
• 1 材料59-61
• 1.1 主要實驗儀器59-60
• 1.2 通用耗材60
• 1.3 主要實驗試劑60-61
• 2 方法61-72
• 2.1 研究方案61-62
• 2.2 PGS流程62
• 2.3 IVF、胚胎活檢、胚胎玻璃化冷凍保存和復(fù)蘇62-64
• 2.4 WGA64
• 2.5 Sure Plex WGA64-67
• 2.6 a CGH67-69
• 2.7 CNV-Seq文庫的構(gòu)建、質(zhì)檢和上機測序69-72
• 3 結(jié)果72-81
• 3.1 CNV-Seq檢測染色體非整倍體72-76
• 3.2 CNV-Seq檢測染色體非平衡易位76-77
• 3.3 CNV-Seq在PGS中的臨床轉(zhuǎn)化研究77-81
• 4 討論81-84
• 小結(jié)84-85
• 參考文獻85-93
• 附錄93-118
• 個人簡歷及研究成果118-120
• 致謝120

  本文關(guān)鍵詞：對不同WGA方法的評估及拷貝數(shù)變異測序技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)篩查中的臨床轉(zhuǎn)化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：275027