發(fā)布時間：2017-03-29 16:18

  本文關鍵詞：MiR-155通過調控S1pr1參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生發(fā)展的作用機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE) (OMIM 152700)是一種典型的全身性自身免疫疾病,主要特征為患者體內可產生大量致病性的自身抗體,且免疫復合物沉積在關節(jié)、肝臟、腎小球、皮膚等部位,引起多器官多系統(tǒng)損傷,女性患病率明顯高于男性。SLE臨床表現(xiàn)復雜多樣,發(fā)病原因復雜,是由環(huán)境因素、性激素和遺傳因素共同作用而引起的。盡管關于SLE的研究在多方面取得了眾多成果,但其具體發(fā)病機制尚未完全闡明。SLE患者自身免疫系統(tǒng)功能紊亂,產生的大量自身抗體及免疫復合物常累積在腎臟,最終導致腎功能衰竭,據流行病學統(tǒng)計數(shù)據顯示約1/3的SLE患者患有腎小球腎炎。SLE患者體內多種免疫細胞均出現(xiàn)異常,已有研究顯示B細胞和T細胞的異�；罨cSLE的發(fā)病有關,此外,患者體內Th1、Th2和Th17各亞型T細胞數(shù)目、功能的異常以及CD4+/CD8+T細胞比例的失衡也是導致SLE發(fā)病的重要原因之一MicroRNA(miRNA)是近20年來發(fā)現(xiàn)的一類內源性的、重要的基因表達調控因子,參與調控眾多生物學過程,比如細胞增殖、凋亡和分化等。目前已證實多種miRNA參與免疫細胞的發(fā)育及免疫應答過程,比如miR-181a、miR-146a及miR-155等。其中miR-155是近幾年來在自身免疫病領域研究較多的miRNA分子。MiR-155定位于人染色體21q21.3,由一個非編碼基因BIC (B cell integration cluster)編碼,其前體位于BIC基因的第3外顯子內。MiR-155的異常表達與多種免疫系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生相關,已經證實BIC基因或者miR-155的過表達與彌漫性大B細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤的發(fā)病相關。目前已證實其可以參與包括B細胞、輔助性T(Th)細胞、調節(jié)性T (Treg)細胞、樹突狀(DC)細胞以及濾泡輔助性T(Tfh)細胞等多種免疫細胞的發(fā)育及應答過程。此外miR-155的異常表達也與多種自身免疫病的發(fā)病相關,如類風濕性關節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)患者的滑膜和滑液巨噬細胞中可檢測到miR-155和炎癥相關因子表達升高,小鼠實驗也證實miR-155-/-小鼠能明顯抵制膠原誘導的關節(jié)炎。MiR-155-/-小鼠還可明顯抵制實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的發(fā)生,且miR-155-/-EAE小鼠脾臟和淋巴結中炎性細胞Thl和Thl7細胞的比例明顯減少。此外,在SLE患者及多種狼瘡樣小鼠的各器官組織中均可檢測到miR-155的異常表達。綜上所述,miR-155可能在自身免疫疾病發(fā)病過程中發(fā)揮促炎作用。盡管關于miR-155與SLE的關系已有部分報道,但具體的機制并不清楚。為明確miR-155參與SLE發(fā)生發(fā)展的具體分子機制,我們采用小鼠模型,在狼瘡小鼠體內缺失miR-155的表達并進一步觀測小鼠狼瘡表型是否得以緩解,并對miR-155是否存在其他的靶基因進行了深入的探究。第一部分 MiR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的構建及表型分析MRL/lpr是目前世界上公認的研究SLE的小鼠模型,我們發(fā)現(xiàn)該狼瘡小鼠的脾臟和胸腺中miR-155表達量明顯高于野生型小鼠。為了在小鼠模型中明確miR-155在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用,我們利用C57BL/6背景下的MRL/lpr小鼠(B6. MRL/lpr)與miR-155-/-小鼠雜交得到兩個基因均為雜合子的Fl代,隨即經過回交和互交的雜交策略,最終得到miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠以及同窩對照Faslpr/lpr小鼠。我們分別選取野生對照小鼠、Faslpr/lpr狼瘡小鼠和miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠進行表型分析,在小鼠40-50周齡時將其處死,觀察并記錄小鼠的各項生理指標。脾臟重量及脾重/體重比是衡量狼瘡小鼠表型嚴重程度的重要指標,于是我們首先對三組小鼠的脾重及脾重/體重比進行了檢測,結果顯示,與野生型小鼠相比,Faslpr/lpr狼瘡小鼠脾腫大癥狀明顯,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠脾腫大癥狀明顯緩解,脾重/體重比也得以恢復。此外,由于狼瘡小鼠體內產生的大量自身抗體及免疫復合物通常累積在腎臟,并最終誘發(fā)狼瘡樣腎炎,于是我們又對兩組小鼠腎臟的損傷程度進行了檢測。通過代謝籠收集不同年齡段小鼠24h的尿液,并利用考馬斯亮藍法檢測兩組小鼠蛋白尿含量,結果顯示40-50周齡的miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠尿蛋白水平顯著低于Faslpr/lpr狼瘡小鼠,而30周齡時,兩組小鼠的尿蛋白含量沒有明顯變化。病理組織學分析也顯示,Faslpr/lpr小鼠的腎臟組織結構紊亂,’腎小球增大,腎小球毛細血管基底膜增厚,有明顯的炎性細胞浸潤,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠腎小球中僅有輕度的炎性細胞浸潤,系膜細胞增生現(xiàn)象也得以減輕。我們又通過免疫熒光實驗對腎臟免疫復合物的沉積狀況進行了檢測,結果證實miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的腎臟中IgM,IgA和C1q的沉積減少。利用ELISA實驗對小鼠血清中的自身性抗體進行檢測也顯示miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠血清中IgM和IgG抗體的滴度降低。在明確了敲除miR-155可緩解Faslpr/lpr小鼠的狼瘡樣表型之后,我們又通過流式細胞術對兩組小鼠T、B淋巴細胞的各亞型的比例進行了檢測,結果顯示與野生小鼠相比,Faslpr/lpr小鼠脾臟和淋巴結中活化的CD4+(CD4+CD69+)T細胞比例明顯增加,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠體內活化的CD4+T細胞比例顯著降低。此外,Faslpr/lpr小鼠體內CD4+CD8+T細胞的比例異常增高,而miR-155敲除的Faslpr/lpr小鼠CD4+/CD8+T細胞比值明顯下降。此外通過CBA(Cytometric beads array)方法對兩組小鼠血清中炎癥細胞相關因子進行檢測,發(fā)現(xiàn)與Faslpr/lpr小鼠相比,miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠血清中與Th2和Thl7細胞相關因子IL-4,IL-17a含量減少,而Thl細胞相關細胞因子IFN-γ在兩組小鼠中并沒有明顯改變。我們對小鼠的脾臟進行PNA染色,結果證實狼瘡小鼠脾臟中有自發(fā)生發(fā)中心(Germinal center)的形成,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠脾臟生發(fā)中心數(shù)目明顯減少。有研究表明濾泡輔助型T(Tfh)細胞參與SLE的發(fā)生發(fā)展,于是我們也對該群細胞的比例及其分泌的因子水平進行了檢測,結果顯示Faslpr/lpr狼瘡小鼠淋巴結中Tfh細胞的比例明顯增加,ELISA實驗結果也證實該小鼠血清中IL-21的濃度增加,而miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠淋巴結中Tfh細胞的比例減少,血清中IL-21的濃度減少。對兩組小鼠脾臟中Il-21和Bcl6 mRNA的表達水平檢測也發(fā)現(xiàn)miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠脾臟中Il-21和Bcl6 mRNA表達水平較Faslpr/lpr小鼠降低。然而對B細胞各亞群(B220+, B220+IgM+, B220+IgD+, B220+CD138+)比例進行檢測的結果顯示兩組小鼠B細胞各亞群均沒有明顯變化。綜合上述結果,我們可以得出如下結論,敲除miR-155可顯著緩解Faslpr/1pr小鼠的狼瘡樣表型。第二部分MiR-155參與SLE發(fā)生發(fā)展的機制探究MicroRNA的生物學功能主要是通過與靶基因mRNA 3'-UTR區(qū)域結合,在轉錄后水平抑制基因的表達。為了進一步探索miR-155參與SLE發(fā)生發(fā)展的機制,尋找miR-155參與SLE發(fā)生調控的靶基因,我們利用表達譜芯片對miR-155-/-小鼠和野生小鼠的脾臟表達譜進行了差異分析。結果顯示與野生型小鼠脾臟相比,miR-155-/-小鼠脾臟有544個基因表達上調和508個基因表達下調(基因表達存在兩倍差異并且P0.05)。通過對表達上調基因與在線軟件miRecord預測到的miR-155人和小鼠共有的靶基因利用Venny 2.0軟件分析,最終確定了4個共同基因—Satb1、H3f3α、Sla以及S1prl。S1PR1 (Sphingosine-1-phosphate receptor 1)全稱為1-磷酸鞘氨醇受體1,屬于S1PR家族,參與激活STAT3等多種信號通路。已有研究證實S1PR1能夠參與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展,我們的研究也發(fā)現(xiàn)S1pr1在小鼠的血液、脾臟和淋巴結等免疫組織表達量較高,且SLE患者外周血淋巴細胞以及狼瘡小鼠的脾臟細胞中S1PR1基因mRNA和蛋白水平均顯著降低,提示其可能參與SLE的發(fā)生發(fā)展。為了驗證miR-155是否直接參與調控SIPR1,我們構建了pmirGLO-S1PR1-3'-UTR載體,與miR-155的mimics或inhibitor共轉染HEK293細胞,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,轉染miR-155的：mimmics細胞雙熒光素酶報告基因活性明顯下降,而與miR-155的inhibitor共轉染則可以顯著上調雙熒光素酶報告基因活性。如果將pmirGLO-S1PR1-3'-UTR載體上與miR-155結合的位點突變后再與miR-155的mimics共轉染HEK293細胞,雙熒光素酶報告基因的活性并沒有顯著改變。接下來我們在HEK293細胞中轉染miR-155的mimics后,發(fā)現(xiàn)S1PR1的表達受到抑制,而轉染miR-155的inhibitor則可上調S1PR1的蛋白水平。以上結果均證實S1PR1是miR。155的一個靶基因。至此,我們已在體外細胞水平證實miR-155可以負向調控S1PR1的表達,接下來我們又在小鼠體內對這一結果進行了驗證。結果顯示與Faslpr/lpr、鼠相比,miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的脾臟中S1pr1不論是在mRNA水平還是蛋白水平表達均上調,對兩組小鼠的腎臟組織切片進行S1pr1的免疫組化實驗,結果也證實miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的腎臟中S1pr1的表達增加,這些均與體外結果相一致。為進一步探索miR-155是否通過調控S1pr1表達參與SLE的發(fā)生發(fā)展,我們利用S1pr1的特異性拮抗劑W146連續(xù)三天腹腔注射miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠,并對小鼠細胞學水平的表型進行了流式檢測。結果發(fā)現(xiàn)與DMSO處理組小鼠相比,W146處理組miR-155-/-Faslpr/tpr小鼠的脾臟和淋巴結中CD4+/CD8+T細胞的比例異常增加,活化的CD4+T細胞比例增多,并且淋巴結中Tfh細胞的比例增加,這提示S1pr1特異性拮抗劑W146可加重miR-155-/-Faslpr/lpr小鼠的狼瘡樣表型。本部分的實驗結果證實miR-155可以通過負向調控S1pr1影響SLE的發(fā)病進程。第三部分S1PR1的轉錄表達調控機制研究我們已證實miR-155通過調控S1PR1的表達參與了SLE的發(fā)展,這提示S1pr1可能作為臨床治療SLE的潛在靶點。我們利用24例SLE患者和34例正常對照對S1PR1的表達情況進行了檢測。實時定量與Western blot結果表明,S1PR1在SLE患者的外周血細胞的mRNA和蛋白水平的表達均低于健康對照,此外,我們還在Faslpr/lpr狼瘡小鼠的脾臟細胞中也得到一致的結果,這就提示S1PR1參與了SLE的發(fā)生發(fā)展。之前已有多篇文獻證實S1PR1不僅與SLE的發(fā)病相關,并且在多種自身免疫疾病患者的組織中也異常表達,目前以S1PR1為靶點治療自身免疫病已有相關的報道并取得了良好的進展。FTY720(Fingolimod,芬戈莫德)是目前治療自身免疫疾病多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis, MS)的常用藥物,其作用靶點之一即為S1PR1。那么,S1PR1除了受microRNA的表觀調控外,其轉錄表達調控機制是什么?是否對治療自身免疫疾病提供潛在的治療價值?基于以上問題我們對S1PR1的啟動子區(qū)域進行了分析,并對可能調控S1PR1的轉錄因子進行了初步的鑒定。我們首先分析了S1PR1轉錄起始點至上游-1 kb啟動子區(qū)域,將系列截短的序列克隆到pGL3-basic載體中,轉染HEK293和HeLa細胞系,依次檢測雙熒光素酶報告基因的活性,結果顯示當序列由-29截短到-12 bp時,雙熒光素酶的活性顯著降低,這提示該區(qū)域內可能存在轉錄因子的結合位點。在該區(qū)域引入突變后,熒光素酶的活性明顯降低,進一步證實該區(qū)域有正向調控的轉錄因子的結合。我們通過PROMO, Jaspar等軟件預測該區(qū)域結合的可能的轉錄因子,發(fā)現(xiàn)有ETS1、FLI1、ELK1、STAT1、STAT3、STAT4、STAT6、C-MYC等轉錄因子的結合位點。我們通過凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)和超遷移率(Supershift)實驗對這些可能結合的轉錄因子進行排除及驗證,結果表明只有p-STAT1抗體與核蛋白孵育后,熱探針與核蛋白的結合條帶發(fā)生改變,提示p-STAT1可能結合于S1PR1啟動子的該區(qū)域。通過建立STAT1過表達及低表達細胞系,我們發(fā)現(xiàn)在過表達STAT1的HeLa細胞系中,S1PR1的mRNA和蛋白水平的表達顯著上調,而在STAT1低表達的HeLa細胞系內S1PR1的mRNA水平表達減少,說明STAT1正向調控S1PR1的表達。以上結果也在HEK293細胞系中得到證實。在高表達STAT1的HeLa細胞系轉染-29 bp熒光素酶載體,雙熒光素酶報告基因的活性明顯增強,而轉染-29bp突變載體以及-12 bp的截短熒光素酶載體時,由于二者均不包含STAT1結合位點,其熒光素酶活性并沒有明顯變化；相對應的,在HeLa細胞中敲低STAT1的表達后,包含STAT1結合位點的野生型載體雙熒光素酶報告基因活性明顯降低,而-29 bp突變載體以及-12 bp的截短載體報告基因活性沒有明顯變化。為驗證STAT1參與調控S1PR1的表達,我們又進行了一系列的功能實驗,結果證實當用STAT1的激活劑IFN-y處理HeLa細胞時,發(fā)現(xiàn)伴隨著STAT1的激活,S1PR1蛋白水平表達增加；而用STAT1特異性抑制劑Fludarabine處理HeLa細胞后,S1PR1蛋白水平的表達下調。另外,我們提取HeLa細胞的蛋白進行染色質免疫沉淀(Chromatin immnunoprecipitation, ChIP)實驗,結果證實在生理條件下,STAT1可以與S1PR1上游啟動子區(qū)域直接結合。接下來我們又在41個健康個體的外周血淋巴細胞中對STAT1與S1PR1在轉錄水平的關系進行了探究,實時定量結果發(fā)現(xiàn),STAT1與S1PR1在mRNA表達水平上呈現(xiàn)明顯的線性正相關(R2=0.4439,P0.01)。通過本部分的實驗結果,我們發(fā)現(xiàn)STAT1可以與S1PR1轉錄起始點上游-29—-12 bp的區(qū)域結合進而正向調控S1PR1的表達。
【關鍵詞】：miR-155 S1PR1 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 轉錄表達調控
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241
【目錄】：

• 中文摘要6-13
• 英文摘要13-21
• 符號說明21-22
• 前言22-28
• 第一部分 MiR-155~(-/-)Fas~(lpr/lpr)狼瘡小鼠模型的構建及表型分析28-54
• 材料和方法30-40
• 結果40-51
• 討論51-54
• 第二部分 MiR-155參與SLE發(fā)生發(fā)展的機制探究54-87
• 材料和方法56-77
• 結果77-85
• 討論85-87
• 第三部分 S1PR1的轉錄表達調控機制研究87-109
• 材料和方法88-98
• 結果98-106
• 討論106-109
• 結論109-110
• 參考文獻110-120
• 致謝120-122
• 綜述：MicroRNA-155參與自身免疫病調控的研究進展122-144
• 參考文獻138-144
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文144-145
• 英文論文Ⅰ145-177
• 英文論文Ⅱ177-188
• 附件188

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前1條

1 陳順樂,胡大偉,石學耕,沈南,顧越英,鮑春;The relationship between Th1/Th2-type cells and disease activity in patients with systemic lupus erythematosus[J];Chinese Medical Journal;2000年10期

  本文關鍵詞：MiR-155通過調控S1pr1參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生發(fā)展的作用機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：274893