目的:探究肌脂蛋白（Sarcolipin,SLN）在衰老骨骼肌纖維化中的作用。方法:不同濃度（0,10,20,40g/L）的D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞衰老,CCK-8檢測其增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測其凋亡狀況;衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶試劑盒對衰老細(xì)胞染色;Western Blot檢測衰老相關(guān)蛋白P16和P53的表達(dá)。Western blot檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β1,及膠原蛋白的主要成分Col1和Col3的蛋白表達(dá);qPCR檢測上述三個(gè)指標(biāo)的mRNA水平的表達(dá)。免疫熒光與qPCR檢測衰老肌細(xì)胞SLN的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)和熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入含SLN基因（Ad-SLN）的重組腺病毒以敲低SLN的表達(dá),轉(zhuǎn)入含綠色熒光蛋白基因（Ad-GFP）的重組腺病毒轉(zhuǎn)作為陰性對照,qPCR和Western blot檢測TGF-β1,轉(zhuǎn)分化相關(guān)指標(biāo)α-SMA及Col1與Col3的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果:D-gal成功誘導(dǎo)C2C12成肌細(xì)胞衰老:CCK8與流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明D-gal濃度在20g/L時(shí)細(xì)胞增殖活性下降明顯,晚期凋亡細(xì)胞數(shù)最多,且總細(xì)胞存活數(shù)... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：45 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

半乳糖誘導(dǎo)

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文16apoptosisforeachgroupwasdetectedbyflowcytometry.Datawereanalyzedusingaone-wayANOVA.*P<0.01vs.controlgroup,(n=3.mean±SD).(E)Senescence-relatedproteinp53andp16expressionlevelsweremeasuredbywesternblotting.GAPDHwasusedastheloadingcontrol.Valuesforthecontrolgroupwerearbitrarilysettoaunitof1.Datawereanalyzedusingaone-wayANOVA.*P<0.05vs.controlgroup,n=3.2.2衰老C2C12細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的變化TGF-β1是經(jīng)典的促纖維化細(xì)胞因子之一，參與組織細(xì)胞纖維化的發(fā)生[19]。為了確定D-gal誘導(dǎo)的肌細(xì)胞衰老是否伴隨纖維化改變，我們測定了TGF-β1，以及ECM的主要成分I型和III型膠原蛋白的表達(dá)情況。如圖2A所示，D-gal誘導(dǎo)細(xì)胞衰老后，TGF-β1和III型膠原蛋白的表達(dá)顯著增加（P＜0.05），但Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)沒有明顯增加。與WesternBlot結(jié)果一致，在D-gal組中，TGF-β1和III型膠原的mRNA表達(dá)顯著增加（P<0.05；圖2B）。我們的數(shù)據(jù)表明，D-gal誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞衰老伴隨細(xì)胞膠原蛋白基因及蛋白表達(dá)的增加，提示有纖維化改變的發(fā)生。圖2D半乳糖對C2C12細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的影響Fig.2EffectofD-galoncollagenexpressioninC2C12cells.（A）通過WesternBlot分析確定TGF-β1，col1和col3的蛋白質(zhì)水平。TGF-β1，col1和col3

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文18圖3D半乳糖誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老對SLN的影響Fig.3EffectofD-gal-inducedC2C12cellonSLN.（A）通過RT-qPCR檢測到的SLN和SERCA2amRNA表達(dá)。*與對照組相比，P<0.05，**P<0.01，與對照組相比（n=3。平均值±SD）。（B）對照組和衰老組的SLN免疫熒光染色。比例尺，20μm。*與對照組相比，P<0.05（n=3。平均值±SD）。（C）WesternBlot分析確定的SERCA2a蛋白表達(dá)。GAPDH作為對照。*與對照組相比，P<0.05（n=3。平均值±SD）。（D）在對照和衰老組細(xì)胞中，使用BBCellProbeF03對鈣進(jìn)行免疫熒光染色30分鐘（×200倍）。（E）通過流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞內(nèi)鈣離子數(shù)量。對照組（A，B，C）的值設(shè)置為1。使用T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)（A，B，C）。(A)SLNandSERCA2amRNAexpressionlevelsasdetectedbyRT-qPCR.*Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05,**P<0.01vscontrolgroup,(n=3.mean±SD).(B)TheimmunofluorescentstainingforSLNoncontrolandD-galdishes.Scalebar,20μm.*Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05(n=3.mean±SD).(C)SERCA2aproteinlevelsasdeterminedbywesternblotanalysis.GAPDHwasusedastheloadingcontrol.*Comparedwiththecontrolgroup,P

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]衰老和運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)變化對骨骼肌重塑的研究進(jìn)展[J]. 金晶,馮祎中,楊洲,馮燕,陳彩珍,盧健.  浙江體育科學(xué). 2017(06)



本文編號：3092368