目的:探討miR-99a在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化及其介導(dǎo)的對(duì)子宮內(nèi)膜癌惡性生物學(xué)表型調(diào)控中的機(jī)制,為深入研究子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及其生物治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法:首先用免疫組化法檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌組織中CD68和CD31表達(dá);免疫磁珠法分選腫瘤間質(zhì)中的CD68陽(yáng)性TAMs,并運(yùn)用miRNAs基因微陣列技術(shù)比較不同浸潤(rùn)深度的子宮內(nèi)膜癌組織中TAMs miRNAs表達(dá)差異;再用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)人單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化;再將人工合成的miR-99a模擬物片段轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞,采用RT-PCR法檢測(cè)miR-99a和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子CD206、CD163以及CD68表達(dá)變化,并運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子IL-12、IL-4和IL-10分泌變化;最后將過(guò)表達(dá)miR-99a的誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞共培養(yǎng),用Transwell法檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-99a對(duì)誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞募集作用的影響,并用CCK-8、Transwell及體外血管擬態(tài)形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲及血管形成能力,WB檢測(cè)可能作用的通路mTOR及其下游蛋白在過(guò)表... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

浸潤(rùn)深度>1/2肌層與浸潤(rùn)深度<1/2肌層的EC患者腫瘤組織中CD68+TAM細(xì)胞及CD31+陽(yáng)性表達(dá)免疫組化示例圖

2.1.2 miR-99a 參與 EC 組織 TAMs 的浸潤(rùn)調(diào)控我們運(yùn)用免疫磁珠法分選出腫瘤間質(zhì)中 CD68+TAMs，運(yùn)用 miRNAs 基因微陣列技術(shù)比較了 8 對(duì)浸潤(rùn)深度>1/2 肌層與浸潤(rùn)深度<1/2 肌層的 EC 患者癌灶組織中TAMs miRNAs 表達(dá)譜的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)深度>1/2 肌層患者組織 TAMs 中miR-99a 的表達(dá)較浸潤(rùn)深度<1/2 肌層患者組織 TAMs 中表達(dá)明顯下降（圖 2）；本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比腫瘤組織中 miR-99a 的表達(dá)明顯下降[8]，提示 miR-99a 的抑癌功能可作用于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的 TAMs。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文25圖3RT-PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)后CD206、CD163及CD68在U937細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3TheexpressionsofCD206,CD163andCD68inU937andM2cellsweredetectedbyRT-PCR.2.2.2過(guò)表達(dá)miR-99a能夠逆轉(zhuǎn)單核細(xì)胞向TAMs極化將誘導(dǎo)后的單核細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-99a及scramble模擬片段，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)其中miR-99a表達(dá)差異，證實(shí)轉(zhuǎn)染后miR-99a后誘導(dǎo)后細(xì)胞miR-99a表達(dá)較對(duì)照組增加（t=19.61，13.81，P值均＜0.01；圖4A）。進(jìn)一步運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-99a后單核細(xì)胞中CD68、CD163以及CD206表達(dá)變化，結(jié)果如圖4B所示，CD68及CD163較對(duì)照組表達(dá)下降（t=8.179，11.78，P值均＜0.01；圖4B），CD206表達(dá)兩組間結(jié)果無(wú)明顯差異（t=0.9951，P＞0.05；圖4B）。運(yùn)用ELISA法我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染miR-99a后誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的差異，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-99a后誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-12分泌增多，而IL-4、IL-10分泌減少（t=6.236，4.896，5.857，P值均＜0.01；圖4C），提示巨噬細(xì)胞向M1型極化，抑制了M2型極化（圖4C），以上結(jié)果表明，EC細(xì)胞共培養(yǎng)后誘導(dǎo)單核細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化，轉(zhuǎn)染miR-99a后能夠抑制單核細(xì)胞向M2型極化。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞研究進(jìn)展[J]. 楊黎,張毅.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2020(02)



本文編號(hào)：3076239