本文關(guān)鍵詞：新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1的NMR研究及日本腦炎病毒衣殼蛋白表達純化　出處：《中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：隨著抗生素的廣泛使用,細菌的耐藥性問題變得日益嚴重,其中由耐藥細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶更是人們研究的熱點。2009年,在印度發(fā)現(xiàn)一種新型β-內(nèi)酰胺酶—新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1)。它能夠分解除了多粘菌素和替加環(huán)素外幾乎所有含β-內(nèi)酰胺環(huán)抗生素,這給臨床醫(yī)療帶來了嚴重的危機。雖然結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們已對NDM-1的結(jié)構(gòu)展開了研究,但詳細的分子作用機制仍不十分清楚。本論文利用常規(guī)核磁共振技術(shù)以及~(19)F核磁共振圍繞NDM-1的溶液結(jié)構(gòu)及分子作用機制展開研究。首先,制備了 ~2H/~(13)C/~(15)N三標(biāo)記NDM-1蛋白樣品,利用常規(guī)三共振譜對di-Zn-NDM-1(功能態(tài))主鏈信號進行了歸屬。在以上信號指認的基礎(chǔ)上,利用TALOS+對di-Zn-NDM-1蛋白二級結(jié)構(gòu)進行了預(yù)測,結(jié)果表明溶液中di-Zn-NDM-1的二級結(jié)構(gòu)與晶體結(jié)構(gòu)整體一致,含有5個α-螺旋、12個β-折疊以及l(fā)oop區(qū)域。該研究對后期用NMR方法獲取NDM-1動力學(xué)信息提供了良好的基礎(chǔ)。同時,也制備了 ~(19)F酪氨酸、色氨酸標(biāo)記的樣品,靈敏直觀地監(jiān)測了apo-NDM-1(無功能態(tài))、di-Zn-NDM-1(功能態(tài))、L-Captopril-bound-NDM-1(去功能態(tài))的~(19)F NMR信號,并利用單點突變法對不同態(tài)的~(19)F信號進行了歸屬,通過核磁共振滴定實驗研究了鋅離子與apo-NDM-1的作用過程。~(19)F和HSQC譜均表明apo-NDM-1結(jié)合Zn2+時,活性中心附近的Loop區(qū)可能存在慢時間尺度的構(gòu)象交換,這說明Zn2+可能不僅僅參與抗生素的水解過程,也可能參與調(diào)控NDM-1活性中心的動態(tài)構(gòu)象變化,從而影響NDM-1催化水解過程中抗生素的結(jié)合以及其水解產(chǎn)物的離去。另外,本文還介紹了日本腦炎病毒衣殼蛋白(JEV-C)的表達與純化。我們構(gòu)建了刪除C末端的疏水區(qū)片段(W114-A127)的衣殼蛋白表達質(zhì)粒,在大腸桿菌(Ecoli)中實現(xiàn)了蛋白的過量表達,并利用Ni柱親和層析、分子篩與凝血酶酶切獲得了符合NMR實驗要求的蛋白質(zhì)樣品,為用核磁共振解析解析衣殼蛋白結(jié)構(gòu)、理解衣殼蛋白在病毒顆粒中的功能奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:This paper studies the structure and molecular mechanism of di - Zn - NDM - 1 ( functional state ) by using conventional nuclear magnetic resonance spectroscopy and ~ ( 19 ) F nuclear magnetic resonance . The results show that the secondary structure of di - Zn - NDM - 1 is consistent with the structure of NDM - 1 .

【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373.31

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本文編號：1362753