本文關(guān)鍵詞：逐級(jí)pH敏感雙方法載多柔比星納米粒的構(gòu)建及共遞送基因的初步評(píng)價(jià)　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：化學(xué)治療(化療)是癌癥治療中最為常用的治療手段。然而傳統(tǒng)化療在臨床應(yīng)用中常出現(xiàn)療效較差、毒副作用過(guò)大等問(wèn)題。如何實(shí)現(xiàn)藥物的有效遞送和可控釋放,從而提高化療治療效果、降低毒副作用是癌癥治療中亟待解決的問(wèn)題。化療與基因治療聯(lián)合治療,是提高腫瘤化療效果、減輕毒副作用的一種常用治療手段。將化療藥物與基因裝載于同一載體中,有利于實(shí)現(xiàn)兩者生物藥劑學(xué)性質(zhì)同步化,確保化療藥物與基因以合適比例遞送至同一靶細(xì)胞。化療與基因治療聯(lián)合治療的研究一直是癌癥聯(lián)合治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái),納米載藥系統(tǒng)在癌癥治療領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)小分子化療藥物相比,納米載藥系統(tǒng)可通過(guò)高通透性和滯留(enhanced permeability and retention effect,EPR)效應(yīng)被動(dòng)靶向于腫瘤組織,可改善藥物體內(nèi)無(wú)選擇性分布,提高腫瘤組織局部藥物濃度,有利于提高抗腫瘤效果、減輕毒副作用。同時(shí),納米載藥系統(tǒng)可將化療藥物與基因裝載于同一載體,在聯(lián)合治療研究領(lǐng)域占有重要地位。納米載藥系統(tǒng)通過(guò)EPR效應(yīng)富集于腫瘤組織后,還需進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)藥物可控釋放,方可發(fā)揮最佳藥效。基于由生理環(huán)境(pH 7.4)到腫瘤微環(huán)境(約pH 6.5)再到腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞體/溶酶體(約pH 5.0)pH的逐級(jí)降低,構(gòu)建具有殼核結(jié)構(gòu)的逐級(jí)pH敏感納米載藥系統(tǒng),在藥物可控遞送領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力。殼核結(jié)構(gòu)逐級(jí)pH敏感納米載藥系統(tǒng)的設(shè)計(jì)理念為:在正常生理組織及血液循環(huán)中,負(fù)電性外殼的包裹可使納米載藥系統(tǒng)維持穩(wěn)定,有利于延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間,避免藥物提前泄露導(dǎo)致對(duì)正常生理組織產(chǎn)生毒性;到達(dá)腫瘤組織后,腫瘤微酸性環(huán)境中,負(fù)電性外殼脫落,暴露出的正電性?xún)?nèi)核易被腫瘤細(xì)胞攝取入胞;入胞后的納米載藥系統(tǒng)在內(nèi)吞體/溶酶體酸性環(huán)境中,進(jìn)一步pH敏感釋放藥物,發(fā)揮抗腫瘤效果。第一重/腫瘤微環(huán)境pH敏感聯(lián)合第二重/細(xì)胞內(nèi)pH敏感的逐級(jí)pH敏感策略,能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的腫瘤細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)釋放,提高抗腫瘤效果、減輕毒副作用。納米載藥系統(tǒng)的高載藥量是發(fā)揮治療效果的基礎(chǔ)。雙方法載藥是提高納米載藥系統(tǒng)中藥物裝載量的常用方法。物理裝載聯(lián)合化學(xué)連接的雙方法載藥策略可彌補(bǔ)單一方法載藥的不足,提高抗腫瘤效果�；谏鲜鲈O(shè)計(jì)理念,本課題采用雙方法載藥策略聯(lián)合逐級(jí)pH敏感策略構(gòu)建了逐級(jí)pH敏感雙方法載鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride,DOX)納米粒。即,首先合成pH敏感腙鍵連接的聚乙烯亞胺-多柔比星結(jié)合物(PEI-C-DOX),隨后選擇21個(gè)堿基對(duì)的寡聚核苷酸(CGA-ODNs)作為物理裝載DOX的載體,經(jīng)室溫孵育獲得載DOX的CGA-ODNs(OD),PEI-C-DOX壓縮OD得到化學(xué)連接聯(lián)合物理裝載的雙方法載DOX復(fù)合物PEI-C-DOX/OD(POD)。以pH敏感兩親性聚電解質(zhì)羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl-chitosan,CMCS)作為外殼材料包裹POD,得到逐級(jí)pH敏感雙方法載DOX納米粒CMCS/POD(CPOD)。在上述研究基礎(chǔ)上,本課題進(jìn)一步采用一步共裝載策略構(gòu)建了 DOX與pDNA共遞送納米粒。即,選擇增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA(enhanced green fluoresycent protein,pEGFP)作為模型基因,PEI-C-DOX 壓縮 OD 與 pEGFP 混合物可實(shí)現(xiàn)藥物與基因一步共裝載,得到共遞送復(fù)合物PEI-C-DOX/ODpEGFP(PODE),PODE外層包裹CMCS得到共遞送納米粒CMCS/PODE(CPODE)。CPODE同樣具有逐級(jí)pH敏感性,并為今后的化療與基因治療聯(lián)合治療奠定了基礎(chǔ)。主要研究方法和結(jié)果如下:1.DOX含量測(cè)定方法建立本章運(yùn)用紫外分光光度法建立DOX體外含量測(cè)定方法,結(jié)果表明DOX在5-35μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9994),低、中、高濃度日內(nèi)、日間精密度及方法回收率符合測(cè)定要求。運(yùn)用熒光分光光度法建立DOX不同pH條件下體外含量測(cè)定方法,結(jié)果表明,pH 7.4條件下DOX在51-1020 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9995),低、中、高濃度日內(nèi)、日間精密度及方法回收率符合測(cè)定要求,pH 5.0條件下DOX在50-1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9993),低、中、高濃度日內(nèi)、日間精密度及方法回收率符合測(cè)定要求。2.逐級(jí)pH敏感載DOX納米粒的構(gòu)建及其理化性質(zhì)初步評(píng)價(jià)本章首先合成PEI-C-DOX,1H-NMR及IR驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。室溫孵育制備OD,熒光光譜掃描確定其最優(yōu)裝載比例為0.12:1。對(duì)OD進(jìn)行初步穩(wěn)定性考察,結(jié)果表明,4℃條件下,24h內(nèi)DOX無(wú)明顯釋放,OD穩(wěn)定性較好。采用靜電自組裝的方式分別構(gòu)建POD及CPOD,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析及理化性質(zhì)初步評(píng)價(jià)對(duì)POD和CPOD分別進(jìn)行處方篩選,確定最優(yōu)處方。POD最優(yōu)處方為PEI與CGA-ODNs質(zhì)量比339:64,CPOD最優(yōu)處方為CMCS與CGA-ODNs質(zhì)量比75:4。最優(yōu)處方POD及CPOD均微觀形態(tài)圓整,粒徑分布較為均勻。POD平均粒徑(140.2±5.2)nm,PDI 0.144±0.018,zeta電位(20.4±1.9)mV。CPOD平均粒徑(165.0±3.3)nm,PDI 0.191±0.001,zeta電位-(15.6±0.82)mV。血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,在10%血漿中,POD穩(wěn)定性較差,CPOD可在24 h內(nèi)保持粒徑穩(wěn)定。溶血實(shí)驗(yàn)表明CPOD在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象,溶血百分率均小于5%,安全性較好。3.CPOD逐級(jí)pH敏感性評(píng)價(jià)及體內(nèi)外抗腫瘤效果初步評(píng)價(jià)。CMCS體外pH敏感脫落實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腫瘤微酸性pH條件下,CMCS可發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)并從CPOD表面脫落。在B16及HepG2兩種細(xì)胞系中,流式細(xì)胞分析結(jié)果表明,pH 6.5及pH 6.0條件下CPOD的攝取率均明顯高于pH 7.4(B16p0.005,HepG2p0.01),驗(yàn)證了CPOD第一重/腫瘤微環(huán)境pH敏感性。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明,48 h,pH 5.0條件下CPOD累積釋放量明顯多于pH 7.4條件下(p0.005)。pH敏感入核實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在B16及HepG2兩種細(xì)胞系中,pH 6.5及pH 6.0條件下CPOD可入胞,并釋放DOX,4 h時(shí)釋放的DOX已基本完全入核,驗(yàn)證了CPOD第二重/胞內(nèi)pH敏感性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,B16細(xì)胞系中,游離DOX細(xì)胞毒性強(qiáng)于CPOD;HepG2細(xì)胞系中,CPOD細(xì)胞毒性與DOX相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),空白納米載體在兩種細(xì)胞系中均未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性,安全性較好。實(shí)時(shí)近紅外小動(dòng)物活體成像結(jié)果表明,CPOD自小鼠靜脈注射給藥1 h時(shí)開(kāi)始富集于腫瘤部位,并持續(xù)至24 h。24 h,CPOD組離體腫瘤熒光強(qiáng)度是游離藥物組的3.46倍,驗(yàn)證了CPOD腫瘤靶向性。荷瘤小鼠模型體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CPOD抑瘤效果優(yōu)于兩倍劑量游離藥物組(瘤體積p0.005,瘤重p0.05),且未導(dǎo)致小鼠體重減輕。組織切片實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CPOD未導(dǎo)致小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、腎)病變,體內(nèi)安全性較好。4.DOX與pEGFP共遞送納米粒的構(gòu)建及初步評(píng)價(jià)構(gòu)建DOX與pEGFP共遞送納米復(fù)合物PODE,CMCS包裹PODE構(gòu)建CPODE,分別對(duì)其進(jìn)行處方考察。PODE最優(yōu)處方為PEI與pEGFP質(zhì)量比68:24,轉(zhuǎn)染效率為11.8±0.10%。CPODE最優(yōu)處方為CMCS與CGA-ODNs質(zhì)量比75:8。最優(yōu)處方PODE及CPODE均微觀形態(tài)圓整,粒徑分布較為均勻,PODE平均粒徑為(77.61±5.7)nm,PDI為0.265±0.019,zeta電位為(4.63±0.33)mV。CPODE平均粒徑為(169.3±3.5)nm,PDI為0.191±0.097,zeta電位為-(12.8±0.61)mV。抗核酸酶能力實(shí)驗(yàn)表明,CPODE抗核酸酶能力優(yōu)于PODE。血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,CPODE血漿穩(wěn)定性較好,可保護(hù)pEGFP不被完全降解。CMCS的包裹可提高CPODE抗核酸酶能力和血漿穩(wěn)定性。CPODE程序性釋放實(shí)驗(yàn)表明,DOX先行釋放,12 h累積釋放量為51.5%,pEGFP釋放需要超過(guò)12 h或更長(zhǎng)時(shí)間。CPODE共遞送行為考察結(jié)果表明,CPODE具有良好的共遞送DOX與pEGFP的潛能,HepG2細(xì)胞系pH 6.0條件下共遞送效率為29.5%。綜上所述,本課題構(gòu)建的新型納米載藥系統(tǒng)CPOD可提高DOX治療效果,且具有較好的安全性,具有潛在應(yīng)用價(jià)值。CPODE可實(shí)現(xiàn)DOX與pDNA共遞送,為化療和基因聯(lián)合治療載體的構(gòu)建提供了一種新思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R943

【參考文獻(xiàn)】

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1 于小越;張娜;;腫瘤微環(huán)境敏感型納米載藥系統(tǒng)[J];藥物生物技術(shù);2015年05期

2 鄧洪新;魏于全;;腫瘤基因治療的研究現(xiàn)狀和展望[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;2015年02期

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本文編號(hào)：1329508