發(fā)布時(shí)間：2023-09-28 22:12

　　2-酮基-L-古龍酸(2-KGA)作為維生素C的前體,工業(yè)上由L-山梨糖在酮古龍酸菌及芽孢桿菌組成的混菌發(fā)酵體系轉(zhuǎn)化獲得。雖然經(jīng)過多年的菌種優(yōu)化,但是各工業(yè)菌種生產(chǎn)2-KGA的能力提高不顯著,其代謝途徑尚不完全清楚。本文對實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的兩株酮古龍酸菌Ketogulonigenium vulgare SPU_B805(需要Bacillus megatherium SPU_B806伴生共發(fā)酵)及Ketogulonigenium robustum SPU_B003(可獨(dú)立發(fā)酵)進(jìn)行了全基因組測序,并與已報(bào)道的需要伴生發(fā)酵的四個(gè)菌株(K.vulgare WSH-001、K.luare Y25、K.vulgare Hbe602及K.vulgare SKV)進(jìn)行比較基因組學(xué)分析,以揭示生長模式及產(chǎn)量不同的機(jī)制。K.vulgare SPU_B805只含有一個(gè)環(huán)狀的基因組,沒有質(zhì)粒,缺失葡萄糖酸2-脫氫酶(分解2-KGA,GA2DH)基因、山梨酮脫氫酶(轉(zhuǎn)化山梨酮為2-KGA,SNDH)、2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮...

【文章頁數(shù)】：168 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語簡表
第一章 前言
    1.1 大宗發(fā)酵
    1.2 典型大宗發(fā)酵產(chǎn)品的生物合成基因改造
        1.2.1 氨基酸
        1.2.2 生物燃料
        1.2.3 有機(jī)酸
        1.2.4 維生素
    1.3 維生素C發(fā)酵
        1.3.1 添加外源物質(zhì)
        1.3.2 分子生物學(xué)研究
        1.3.3 組學(xué)研究
    1.4 啟動(dòng)子研究
        1.4.1 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)
        1.4.2 啟動(dòng)子工程策略
    1.5 代謝途徑的研究
        1.5.1 經(jīng)典代謝途徑
        1.5.2 磷酸轉(zhuǎn)酮酶途徑
    1.6 立題依據(jù)
第二章 酮古龍酸菌基因組分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        2.1.2 培養(yǎng)基及試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 發(fā)酵檢測
        2.2.2 全基因組測序
        2.2.3 基因組注釋
        2.2.4 代謝途徑分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 K.vulgare SPU_B805基因組分析
        2.3.2 K.robustum SPU_B003基因組分析
        2.3.3 K.vulgare種內(nèi)比較基因組分析
        2.3.4 Ketogulonigenium種間比較基因組分析
    2.4 小結(jié)
    2.5 討論
第三章 K.robustum SPU_B003啟動(dòng)子的研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 引物
        3.1.3 培養(yǎng)基及試劑
        3.1.4 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 啟動(dòng)子預(yù)測
        3.2.2 啟動(dòng)子活性檢測質(zhì)粒構(gòu)建流程
        3.2.3 基因操作
        3.2.4 熒光檢測
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 啟動(dòng)子預(yù)測結(jié)果
        3.3.2 含啟動(dòng)子的質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
        3.3.3 啟動(dòng)子活性結(jié)果
    3.4 小結(jié)
    3.5 討論
第四章 XFP-PTA糖代謝途徑在酮古龍酸菌中的構(gòu)建
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株及質(zhì)粒
        4.1.2 引物
        4.1.3 培養(yǎng)基及試劑
        4.1.4 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建流程
        4.2.2 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.2.3 SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)
        4.2.4 蛋白純化與透析
        4.2.5 蛋白含量檢測
        4.2.6 乙酰磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
        4.2.7 磷酸轉(zhuǎn)酮酶酶活檢測
        4.2.8 磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶酶活檢測
        4.2.9 乙酰輔酶A含量檢測
        4.2.10 RNA提取及完整性檢測
        4.2.11 cDNA的合成
        4.2.12 RT-qPCR
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 xfp體外表達(dá)
        4.3.2 pta體外表達(dá)
        4.3.3 密碼子的優(yōu)化
        4.3.4 XFP-PTA代謝途徑構(gòu)建
        4.3.5 XFP體內(nèi)活性檢測
        4.3.6 PTA體內(nèi)活性檢測
        4.3.7 乙酰輔酶A含量檢測
        4.3.8 重組菌的生長曲線
        4.3.9 重組菌的2-酮基-L-古龍酸含量檢測
        4.3.10 重組菌部分基因轉(zhuǎn)錄水平檢測
    4.4 小結(jié)
    4.5 討論
全文總結(jié)
全文討論
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
致謝
附錄



本文編號：3848709