【摘要】：L-異亮氨酸屬于支鏈氨基酸,必需氨基酸,作為大宗傳統(tǒng)工業(yè)微生物發(fā)酵氨基酸在食品、醫(yī)藥制劑、飼料等方面已有廣泛的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)IWJ001是本實(shí)驗(yàn)室研究多年的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株,針對(duì)該菌株的代謝研究已完成RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和二維電泳聯(lián)用MALDI-TOF蛋白組數(shù)據(jù),本研究以蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)為切入點(diǎn),在谷氨酸棒桿菌IWJ001中構(gòu)建以強(qiáng)化L-異亮氨酸生產(chǎn)為目標(biāo)的一系列基因工程菌株,同時(shí)針對(duì)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行了假設(shè)的提出和初步驗(yàn)證。主要研究結(jié)論如下:(1)通過(guò)強(qiáng)化磷酸戊糖途徑碳流來(lái)強(qiáng)化L-異亮氨酸生產(chǎn)。對(duì)基因工程菌IWJ001/pDXW-8-gnd、IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp和IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp-pgl重組菌株的生產(chǎn)性能進(jìn)行了初步評(píng)估:發(fā)現(xiàn)單基因表達(dá)菌株在胞內(nèi)NADPH水平、前24 h L-異亮氨酸產(chǎn)量具有優(yōu)勢(shì);雙基因共表達(dá)菌株在產(chǎn)率系數(shù)方面具有優(yōu)勢(shì);三基因共表達(dá)菌株在代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有優(yōu)勢(shì),L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到10.9 g/L,比對(duì)照組提高65%。IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp-pgl在補(bǔ)料分批發(fā)酵中,L-異亮氨酸生產(chǎn)能力達(dá)到0.345 g/L/h、產(chǎn)率系數(shù)達(dá)到0.138 g/g、L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到29.0 g/L,L-異亮氨酸產(chǎn)量比對(duì)照組提高21%。(2)構(gòu)建了IWJ001/pDXW-8-cysK以研究半胱氨酸合成酶A的過(guò)表達(dá)對(duì)L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。IWJ001/pDXW-8-cysK搖瓶發(fā)酵L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了26.5%,產(chǎn)率系數(shù)提高了10.5%,L-異亮氨酸合成途徑基因aspC、lysC、hom、thrB、ilvA、ilvBN的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.0、5.6、7.2、4.4、3.5、7.5倍。證明CysK過(guò)表達(dá)對(duì)于L-異亮氨酸合成途徑碳流有促進(jìn)作用。在細(xì)胞培養(yǎng)期間觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)模式為“先抑后揚(yáng)”,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化即在延滯期和對(duì)數(shù)前期,細(xì)胞形態(tài)變得更粗、大、長(zhǎng)。同時(shí)IWJ001/pDXW-8-cysK細(xì)胞菌膜形成能力顯著降低,無(wú)肉眼可見菌膜形成,通過(guò)定量分析發(fā)現(xiàn)IWJ001/pDXW-8-cysK的菌膜形成能力下降71.3%。通過(guò)對(duì)膜滲透性進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)IWJ001/pDXW-8-cysK的膜滲透性提高15.8%。(3)通過(guò)異源表達(dá)來(lái)自羅氏真養(yǎng)菌的phaCAB基因簇,構(gòu)建了一株谷氨酸棒桿菌聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(PHBV)和L-異亮氨酸的基因工程聯(lián)產(chǎn)菌株。搖瓶發(fā)酵水平L-異亮氨酸產(chǎn)量提高44%,達(dá)到9.58 g/L,產(chǎn)率系數(shù)比對(duì)照組提高65%,L-異亮氨酸合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平小幅提高。此外分別構(gòu)建了單表達(dá)phaA和雙表達(dá)phaAB的菌株IWJ001/pDXW-8-phaA和IWJ001/pDXW-8-phaAB,通過(guò)搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)只有IWJ001/pDXW-8-phaCAB可以顯著提高L-異亮氨酸產(chǎn)量并在胞內(nèi)積累聚羥基脂肪酸酯(PHA)顆粒。在補(bǔ)料分批發(fā)酵中,IWJ001/pDXW-8-phaCAB的L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到30.1 g/L,產(chǎn)率系數(shù)達(dá)到0.129 g/g,比對(duì)照組提高27%。(4)對(duì)胞內(nèi)積累的PHA顆粒進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)其單體構(gòu)成為3-羥基丁酸和3-羥基戊酸,即證明胞內(nèi)顆粒為PHBV。定量實(shí)驗(yàn)確定其3HV的摩爾比例為58.1%,PHBV占細(xì)胞干重比例28.7%。在ATCC13869中構(gòu)建的ATCC13869/pDXW-8-phaCAB使用同樣的培養(yǎng)條件搖瓶發(fā)酵,胞內(nèi)積累的顆粒為PHB而非PHBV。對(duì)IWJ001胞內(nèi)丙酰輔酶A進(jìn)行定量發(fā)現(xiàn)IWJ001中的丙酰輔酶A較ATCC13869提高了16.9倍,達(dá)到了0.95 mg/L(1.35μM),并進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和補(bǔ)料分批發(fā)酵數(shù)據(jù)進(jìn)一步推測(cè)了丙酰輔酶A的來(lái)源是2-酮丁酸。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)合成丙酰輔酶A的代謝通路極度活躍,相關(guān)的編碼基因prpB、prpC、prpD、dtsR1和msmA分別上調(diào)了338、104、56、4.6和4.9倍。在補(bǔ)料分批發(fā)酵中,3HV比例與L-異亮氨酸合成過(guò)程高度相關(guān),發(fā)酵過(guò)程中3HV比例在35.1%-75.2%之間變化,PHBV產(chǎn)量為15.2 g/L,占細(xì)胞干重的20%,其中3HV摩爾比例為75.2%,是目前以葡萄糖為碳源的最高3HV比例。進(jìn)一步敲除丙酰輔酶A分解代謝基因prpC,構(gòu)建了IWJ001ΔprpC,較IWJ001的丙酰輔酶A水平提高了3.8倍。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ922
【圖文】：

解性、生物相容性以及 PHA 塑料的熱加材料和生物可降解包裝材料。除此之外，性光學(xué)活性等高附加值性能，所以除了可廣泛應(yīng)用于粘合材料、醫(yī)學(xué)植入材料[36]產(chǎn)品、自動(dòng)化產(chǎn)品、精細(xì)化學(xué)等方面。目BHHx[39]三種 PHA 材料，其單體分別含有 1-2 所示，聚酯單體的羧基與相鄰單體的A 的主要區(qū)別是不同的 C3 位側(cè)鏈基團(tuán)，羥基丁酸酯（PHB），側(cè)鏈基團(tuán)可以有很多 3 之間變化，另外根據(jù)單體的不同排列方嵌段共聚物等多重結(jié)構(gòu)，上述大量的側(cè)鏈以以兩個(gè)或兩個(gè)以上的種類，多種比例，化接近于無(wú)限。這種多元化的結(jié)構(gòu)帶來(lái)了多樣化，使其在實(shí)際的應(yīng)用中較之其他材

江南大學(xué)博士學(xué)位論文酰輔酶 A 或一個(gè)乙酰輔酶 A、一個(gè)丙酰輔酶 A，產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶 A 或酮基戊 A，第二步由依賴于 NADPH 的乙酰乙酰輔酶 A 還原酶(由 phaB 編碼)催化立體反應(yīng)，從乙酰乙酰輔酶 A 或酮基戊酰輔酶 A 產(chǎn)生(R)-3-羥基丁酰輔酶 A 或(R)-3-酰輔酶 A。第三步依賴 PHA 聚合酶(由 phaC 編碼)的作用下將(R)-3-羥基脂酰輔體聚合，產(chǎn)生 PHAs，同時(shí)釋放游離的輔酶 A。在某些微生物比如惡臭假單胞菌真養(yǎng)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中存在 PHA 合成途徑，而在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌則并不A 合成酶。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 浦軍平,陳剛,王開國(guó);L-異亮氨酸發(fā)酵工藝條件的研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2003年02期

本文編號(hào)：2727438