【摘要】：L-異亮氨酸屬于支鏈氨基酸,必需氨基酸,作為大宗傳統(tǒng)工業(yè)微生物發(fā)酵氨基酸在食品、醫(yī)藥制劑、飼料等方面已有廣泛的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)IWJ001是本實驗室研究多年的L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株,針對該菌株的代謝研究已完成RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和二維電泳聯(lián)用MALDI-TOF蛋白組數(shù)據(jù),本研究以蛋白組學數(shù)據(jù)為切入點,在谷氨酸棒桿菌IWJ001中構(gòu)建以強化L-異亮氨酸生產(chǎn)為目標的一系列基因工程菌株,同時針對研究過程中發(fā)現(xiàn)的科學問題進行了假設(shè)的提出和初步驗證。主要研究結(jié)論如下:(1)通過強化磷酸戊糖途徑碳流來強化L-異亮氨酸生產(chǎn)。對基因工程菌IWJ001/pDXW-8-gnd、IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp和IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp-pgl重組菌株的生產(chǎn)性能進行了初步評估:發(fā)現(xiàn)單基因表達菌株在胞內(nèi)NADPH水平、前24 h L-異亮氨酸產(chǎn)量具有優(yōu)勢;雙基因共表達菌株在產(chǎn)率系數(shù)方面具有優(yōu)勢;三基因共表達菌株在代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平方面具有優(yōu)勢,L-異亮氨酸產(chǎn)量達到10.9 g/L,比對照組提高65%。IWJ001/pDXW-8-gnd-fbp-pgl在補料分批發(fā)酵中,L-異亮氨酸生產(chǎn)能力達到0.345 g/L/h、產(chǎn)率系數(shù)達到0.138 g/g、L-異亮氨酸產(chǎn)量達到29.0 g/L,L-異亮氨酸產(chǎn)量比對照組提高21%。(2)構(gòu)建了IWJ001/pDXW-8-cysK以研究半胱氨酸合成酶A的過表達對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響。IWJ001/pDXW-8-cysK搖瓶發(fā)酵L-異亮氨酸產(chǎn)量提高了26.5%,產(chǎn)率系數(shù)提高了10.5%,L-異亮氨酸合成途徑基因aspC、lysC、hom、thrB、ilvA、ilvBN的轉(zhuǎn)錄水平分別提高了2.0、5.6、7.2、4.4、3.5、7.5倍。證明CysK過表達對于L-異亮氨酸合成途徑碳流有促進作用。在細胞培養(yǎng)期間觀察到細胞生長模式為“先抑后揚”,同時細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化即在延滯期和對數(shù)前期,細胞形態(tài)變得更粗、大、長。同時IWJ001/pDXW-8-cysK細胞菌膜形成能力顯著降低,無肉眼可見菌膜形成,通過定量分析發(fā)現(xiàn)IWJ001/pDXW-8-cysK的菌膜形成能力下降71.3%。通過對膜滲透性進行定量分析發(fā)現(xiàn)IWJ001/pDXW-8-cysK的膜滲透性提高15.8%。(3)通過異源表達來自羅氏真養(yǎng)菌的phaCAB基因簇,構(gòu)建了一株谷氨酸棒桿菌聚3-羥基丁酸-3-羥基戊酸酯(PHBV)和L-異亮氨酸的基因工程聯(lián)產(chǎn)菌株。搖瓶發(fā)酵水平L-異亮氨酸產(chǎn)量提高44%,達到9.58 g/L,產(chǎn)率系數(shù)比對照組提高65%,L-異亮氨酸合成途徑基因轉(zhuǎn)錄水平小幅提高。此外分別構(gòu)建了單表達phaA和雙表達phaAB的菌株IWJ001/pDXW-8-phaA和IWJ001/pDXW-8-phaAB,通過搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)只有IWJ001/pDXW-8-phaCAB可以顯著提高L-異亮氨酸產(chǎn)量并在胞內(nèi)積累聚羥基脂肪酸酯(PHA)顆粒。在補料分批發(fā)酵中,IWJ001/pDXW-8-phaCAB的L-異亮氨酸產(chǎn)量達到30.1 g/L,產(chǎn)率系數(shù)達到0.129 g/g,比對照組提高27%。(4)對胞內(nèi)積累的PHA顆粒進行鑒定,發(fā)現(xiàn)其單體構(gòu)成為3-羥基丁酸和3-羥基戊酸,即證明胞內(nèi)顆粒為PHBV。定量實驗確定其3HV的摩爾比例為58.1%,PHBV占細胞干重比例28.7%。在ATCC13869中構(gòu)建的ATCC13869/pDXW-8-phaCAB使用同樣的培養(yǎng)條件搖瓶發(fā)酵,胞內(nèi)積累的顆粒為PHB而非PHBV。對IWJ001胞內(nèi)丙酰輔酶A進行定量發(fā)現(xiàn)IWJ001中的丙酰輔酶A較ATCC13869提高了16.9倍,達到了0.95 mg/L(1.35μM),并進一步通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和補料分批發(fā)酵數(shù)據(jù)進一步推測了丙酰輔酶A的來源是2-酮丁酸。通過轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)合成丙酰輔酶A的代謝通路極度活躍,相關(guān)的編碼基因prpB、prpC、prpD、dtsR1和msmA分別上調(diào)了338、104、56、4.6和4.9倍。在補料分批發(fā)酵中,3HV比例與L-異亮氨酸合成過程高度相關(guān),發(fā)酵過程中3HV比例在35.1%-75.2%之間變化,PHBV產(chǎn)量為15.2 g/L,占細胞干重的20%,其中3HV摩爾比例為75.2%,是目前以葡萄糖為碳源的最高3HV比例。進一步敲除丙酰輔酶A分解代謝基因prpC,構(gòu)建了IWJ001ΔprpC,較IWJ001的丙酰輔酶A水平提高了3.8倍。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ922
【圖文】：

解性、生物相容性以及 PHA 塑料的熱加材料和生物可降解包裝材料。除此之外，性光學活性等高附加值性能，所以除了可廣泛應(yīng)用于粘合材料、醫(yī)學植入材料[36]產(chǎn)品、自動化產(chǎn)品、精細化學等方面。目BHHx[39]三種 PHA 材料，其單體分別含有 1-2 所示，聚酯單體的羧基與相鄰單體的A 的主要區(qū)別是不同的 C3 位側(cè)鏈基團，羥基丁酸酯（PHB），側(cè)鏈基團可以有很多 3 之間變化，另外根據(jù)單體的不同排列方嵌段共聚物等多重結(jié)構(gòu)，上述大量的側(cè)鏈以以兩個或兩個以上的種類，多種比例，化接近于無限。這種多元化的結(jié)構(gòu)帶來了多樣化，使其在實際的應(yīng)用中較之其他材

江南大學博士學位論文酰輔酶 A 或一個乙酰輔酶 A、一個丙酰輔酶 A，產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶 A 或酮基戊 A，第二步由依賴于 NADPH 的乙酰乙酰輔酶 A 還原酶(由 phaB 編碼)催化立體反應(yīng)，從乙酰乙酰輔酶 A 或酮基戊酰輔酶 A 產(chǎn)生(R)-3-羥基丁酰輔酶 A 或(R)-3-酰輔酶 A。第三步依賴 PHA 聚合酶(由 phaC 編碼)的作用下將(R)-3-羥基脂酰輔體聚合，產(chǎn)生 PHAs，同時釋放游離的輔酶 A。在某些微生物比如惡臭假單胞菌真養(yǎng)菌的代謝網(wǎng)絡(luò)中存在 PHA 合成途徑，而在大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌則并不A 合成酶。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 浦軍平,陳剛,王開國;L-異亮氨酸發(fā)酵工藝條件的研究[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2003年02期

本文編號：2727438