【摘要】：為了實現(xiàn)烏賊副產(chǎn)物的高值化利用,本文以虎斑烏賊(Sepia pharaonis)生殖腺為原料,采用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)液態(tài)發(fā)酵法制備抗氧化肽,對烏賊生殖腺抗氧化肽的體外抗氧化活性及其穩(wěn)定性進行了研究,并采用多種分離技術(shù)對抗氧化肽實現(xiàn)了逐級分離純化。主要的研究內(nèi)容和結(jié)論如下:(1)虎斑烏賊生殖腺具有高蛋白(62.71 g/100g)、低脂肪(0.52 g/100g)的特點,其氨基酸種類豐富、組成合理,可作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白源用于抗氧化肽的開發(fā)。以虎斑烏賊生殖腺作為唯一的發(fā)酵基質(zhì),研究了枯草芽孢桿菌發(fā)酵過程中相關(guān)指標的動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長良好,且具有一定的產(chǎn)蛋白酶能力,能夠?qū)踬\生殖腺蛋白降解為小分子多肽和氨基酸,進而引起發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量、羥自由基清除率和還原力的動態(tài)變化。以發(fā)酵液的蛋白酶活力和非蛋白氮含量為評價指標,研究了底物濃度、培養(yǎng)基的初始pH值、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對發(fā)酵過程的影響。在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝,得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵烏賊生殖腺的最適條件為:發(fā)酵底物濃度為30 mg/mL,培養(yǎng)基的初始pH值為6.0,發(fā)酵溫度為34℃,發(fā)酵時間為60 h。在此條件下,發(fā)酵液的蛋白酶活力為66.66 u/mL,非蛋白氮含量為1.10 mg/mL。(2)烏賊生殖腺多肽的粗蛋白含量為52.37 g/100g,蛋白質(zhì)利用率為34.64%,其氨基酸組成中,賴氨酸和天冬氨酸含量最高,疏水性氨基酸和抗氧化氨基酸的含量分別占總氨基酸的39.1%和63.3%,具有良好的抗氧化潛力。烏賊生殖腺多肽具有一定的體外抗氧化活性,其DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和亞鐵離子螯合率的IC_(50)值分別為14.99、21.22、7.95和1.75 mg/mL,但其還原力相對較弱,AC_(0.5)值為41.32 mg/mL。對其抗氧化活性的穩(wěn)定性進行了研究,發(fā)現(xiàn)溫度、食品配料(包括NaCl、蔗糖和檸檬酸)、防腐劑(包括苯甲酸鈉和山梨酸鉀)及金屬離子中的K~+、Mn~(2+)、Ca~(2+)的對烏賊生殖腺多肽的活性保持率影響不大,而強酸環(huán)境和Zn~(2+)對其活性保持率影響較大。(3)以DPPH自由基清除率為主要的評價指標,采用超濾法、Sephadex G-25凝膠過濾層析法和RP-HPLC對烏賊生殖腺多肽進行逐級分離純化,得到的組分SPGPs-2D-2具有最高的DPPH自由基清除率(70.61%,1 mg/mL),與分離前相比(67.26%,30mg/mL),提高了至少30倍,烏賊生殖腺抗氧化肽得到了有效富集。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.63;TQ936.16
【圖文】：

第四章 烏賊生殖腺多肽的分離純化4.4.3 RP-HPLC 分離純化 SPGPs-2DRP-HPLC 是根據(jù)樣品中各組分的極性差異而實現(xiàn)分離的色譜技術(shù)，具有分辨率高、分析速度快、回收率高等特點，廣泛應(yīng)用于多肽的分離純化和制備。將凝膠過濾層析分離后得到的抗氧化活性最高的組分 SPGPs-2D 利用 RP-HPLC 進一步分離。4.4.3.1 RP-HPLC 的分離條件優(yōu)化在 RP-HPLC 的分離純化中，影響樣品分離效果的因素有很多，本次實驗選擇流動相和洗脫流速兩個主要的影響因素對 SPGPs-2D 的分離條件進行初步優(yōu)化。（1）流動相的選擇（A）

三氟乙酸水溶液（A）、5%甲醇和 95%三氟乙酸水溶液（B），洗脫流速為 1 mL/min 時，觀察其色譜圖的峰形變化。與甲醇相比，乙腈造成的色譜柱背壓相對更小，流動相流動過程中的阻力減小，使得縱向擴散減少，因此最終的峰形更加窄而高。但甲醇對樣品的分離度高于乙腈，因此最終選擇 5%甲醇和 95%三氟乙酸溶液作為流動相。（2）流速的選擇洗脫流速也是影響 RP-HPLC 中樣品分離的重要因素之一。流速過低時，樣品的保留時間過長，使得樣品的分離效率降低。流速過高時，柱背壓增大，影響樣品的分離效果。如圖 4-4 所示，固定流動相為 5%甲醇和 95%三氟乙酸，與洗脫流速為 1mL/min 的色譜圖（見圖 4-3（B））相比，洗脫流速為 0.5mL/min 時樣品的分離度更高，分離效果更好。因此，選擇洗脫流速為 0.5mL/min 作為下一步分離純化的參考值。根據(jù)分析柱與制備柱之間流速的線性放大規(guī)律，最終選擇洗脫流速為 1mL/min 作為 RP-HPLC 制備柱的最佳流速。

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本文編號：2727005